Спосіб мінімізації деградації активованого протеїну с (варіанти), фармацевтична композиція та водний розчин активованого протеїну с

1. Способ минимизации деградации активированного протеина С, отличающийся тем, что включает в себя удерживание указанного активированного протеина С в растворе с рН от около 6,3 до около 7,0. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрация соли в указанном растворе либо ниже, чем приблизительно 0,050 М, либо выше, чем приблизительно 0,40 М. 3. Способ по п. 1, в котором рН составляет от 6,3 до 6,5. 4. Способ по п. 1, в котором рН составляет 6,3. 5. Способ по п. 1, в котором рН составляет 6,4. 6. Способ по п. 1, в котором рН составляет 6,5. 7. Способ по п. 1, дополнительно включающий в себя лиофилизацию указанного раствора. 8. Способ по п. 2, отличающийся тем, что концентрация соли в указанном растворе ниже, чем приблизительно 0,050 М. C2 (54) СПОСІБ МІНІМІЗАЦ ІЇ ДЕГРАДАЦІЇ АКТИВОВАНОГО ПРОТЕЇНУ С (ВАРІАНТИ), ФАРМАЦ ЕВТИЧНА КОМПОЗИЦІЯ ТА ВОДНИЙ РОЗЧИН АКТИВОВАНОГО ПРОТЕЇНУ С 39178 чего получают 9 остатков гамма-карбоксиглутаминовой кислоты; и 4) присоединение углеводов по четырем сайтам (один в легкой цепи, а три – в тяжелой). Тяжелая цепь содержит хорошо известную триаду се рин-протеазы Asp 257, His 211 и Ser 360. И, наконец, цирбуляция 2-цепочечного зимогена активируется ин виво тромбином у поверхности фосфо липида в присутствии иона кальция. Активи рование происхо дит за счет уда ления додекапептида по N-концу тяжелой цепи, в результате чего образуется активи рованный протеин М (аРС), обладающий энзимати ческой активностью. При работе с большими количествами и высокими концентрациями аРС наблюдается протеолитический разрыв (Clip) по лизинному остатку в положении 308 тяжелой цепи. Последовательность нового N-конца, образующегося в результате этого разрыва, начинается с CGlu-Ala-Lys и приводит к образова нию III аминокислотного фрагмента, названного "ЕКА фрагментом" из С-терминального конца тяжелой цепи. ЕАК фрагмент ковалентно не связан с легкой цепью или N-концевым участком тяжелой цепи за счет дисуль фидных связей. ЕАК фрагмент содержит также активный сайт серии из серин-протеазы, но не содержит остатков Asp или His. Так было обнаружено, что препараты протеина С с ЕАК фрагментом имеют измененную антикоагулянтную активность. Настоящее изобретение включает способы предотвращения или минимизации деградации молекулы протеина С за счет содержания молекулы при пониженных рН, в де натурирующем агенте или при экстремальных концентрациях соли. Для целей настояще го изобрете ния в части его раскрытия и в формуле изобретения использованы следующие тер мины: аРС – активированный человеческий протеин С АРТТ – время частичной активации тромбопластина Au – амидолитические единицы ВМЕ-бе та-меркаптоэтанол CHES-2(N-циклогексиламино)этансульфокислота ЕАК фрагмент – Фрагмент III аминокислот, возникающий при разрыве в положении 308 тяжелой цепи протеина С ЕДТА – эти лендиаминтетрауксусная кислота НЕРЕS-N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфокислота НРС – зимоген челове ческого протеина С МЕА – 2-аминоэтанол MES – 2(N-морфо лино)-этансульфо кислота "Возникающий" (Nascent) протеин - полипептид, образующийся при трансляции мРНК транскрипта до любой посттрасляционной модифи кации. Однако такие посттрансляционные модифи кации, как гамма-карбоксилирование остатков глутаминовой кислоты и гидроксилирование остатков аспаргиновой кислоты, могут начаться до того, как протеин будет полностью транслирован с мРНК транскрипта. Активность протеина С – любое свойство протеина С человека ответственное за протеолитическую, амидолитическую, эсте ролитическую и биологическую (антикоагулянтную или профибринолитическую) активности. Способы тестирования анти коагулянтной и амидолитической активностей протеина С хорошо известны специалистам, например, см. Grinnell et. al. 1987, Bio/Technology 5:1189-1192. гНРС – рекомбинантно полученный зимоген человеческого протеина С. Зимоген – энзимати чески неактивный предшественник протеолитического энзима. Зимоген протеина С, в том смысле, как здесь использован, обозначает секретированные неактивные формы, одной или двух цепей протеина С. Все сокраще ния, касающиеся аминокислот и использованные в настоящем описании, соответствуют принятым Патентным Ведомством США и указанным в 37 С, F, R. § 1.822/b/ /2/ (1990). Настоящее изобретение относится к способам предотвращения или минимизации аутодеградации активированного протеина С. Настоящее изобретение иллюстрируется осуществлением процессинга очистки и/или хранения активированного протеина С при низких значениях рН, например, от около 6,3 до около 7,0. Аутодеградация аРС может быть также сведена к минимуму за счет инкубирования аРС в ЗМ мочевине (полное выделение аРС активности достигается после удаления денатурирующе го агента) или за счет инкубирования аРС в присутствии экстремальных концентраций соли. Для целей настоящего описания экстремальная концентрация соли означает концентрацию выше, чем около 0,4 моля, или ниже, чем около 0,05 молей. Настоящее изобретение включает также аРС композиции, которые поддерживают аРС при низких значениях рН, в денатурирующем агенте, или при экстремальных концентрациях соли. Роль протеина С в поддержании гемостаза привлекает большой инте рес с этому соединению, как к терапевтическому агенту для ши рокого круга сосудисты х заболеваний. Получение протеина С человека в больши х количествах и с вы сокими концентрациями привело к обнаружению того факта, что молекула может претерпевать аутодеградацию, что, в свою оче редь, ведет к снижению актикоагулянтной активности. Аутодеградация аРС приводит к образованию фрагмента III аминокислот, называемого "ЕАК фрагментом", из С-терминального конца тяжелой цепи. ЕАК фрагмент не присоединен ковалентно к легкой цепи или N-терминальному участку тя желой цепи за счет дисульфидных связей. ЕАК фрагмент содержит также активный сайт сериново го остатка серин-протеазы, но не содержит Аsp или His остатков. Таким образом, препараты протеина С и ЕАК фрагментом обладают измененной антикоагулянтной активностью за счет присутствия протеолитического разрыва. Для уменьшения или предотвращения аутодеградации, которая ведет к образованию ЕАК фрагмента, интактную активированную молекулу протеина С можно содержать при рН от около 6,3 до около 7,0. Мо лекулу н ужно содержать в условиях с рН в этом интервале на протяжении всех процессов очистки и активации, а также при получении окончательного раствора композиции. Для поддержания рН раствора можно использовать множество различных буферных систем. Представители таких буфер ных систем включают Трисацетат, цитрат натрия, цитрат-глицин и фосфат 2 39178 натрия. Специалистам известно и множество других буферных систем, которые доступ ны, и которые можно использовать в способах настоящего изобретения. Другой аспект настоящего изобретения относится к предотвраще нию или уменьше нию образования ЕАК фрагмента за счет поддержания активированной молекулы протеина С в растворе с экстремальной концентрацией соли. Так, например, при рН 7,0 в натрий фосфатном буфе ре образование фрагмента ЕАК минимально, если в буфе ре нет соли. Однако, при рН 7,0 в натрийфосфатном буфе ре образование ЕАК фрагмента также минимально, если концентрация натрийхлорида в буфе ре составляет около 0,4М. Между этими двумя концентрациями соли образование ЕАК фрагмента происходит с различными скоростями; но специалистам должно быть ясно, что поддержание концентраций соли между 0,05М и около 0,4М наиболее легко предотвращает или минимизирует образование ЕАК фрагмента. Предпочтительны другие концентрации соли ниже 0,05М (например, 0,01М или 0,005М), хотя наилучшие фармацевтические композиции соответствуют значениям рН около 7,0 без добавления к раствору соли. Специалистам должно быть ясно, что можно использовать много различных солей при получении фармацевтических соединений и композиций. Представители подходящи х для использования солей включают хлорид калия, хлорид кальция и, что наиболее предпочтительно, хлорид натрия. Еще один аспект изобретения относится к предотвращению или уменьшению аутодеградации активированного протеина С за счет осуществления очистки и/или получения композиции в присутствии денатурирующе го агента. Можно использовать многие денатурирующие агенты, но наиболее предпочтительным агентом является мочевина в концентрациях около 3М. Настоящее изобретение не ограничено способами получения акти вированного протеина С. Хо тя наиболее эффективно получение молекул активированного протеина С с использованием рекомбинантной технологии ДНК, последние достижения в области крупномасштабной очистки протеина позволяют выделять значительные количества активированного протеина С из сыворотки человека. Получение таких больших количеств протеина С позволяет одновременно обрабатывать высокие концентрации активированного протеина С. Как было указано ранее, авторы обнаружили, что концентрации акти вированного протеина С выше уровня около 50 мгк/мл демонстрируют аутодеградацию молекул акти вированного протеина С, сопровождающееся соответствующим падением антикоагулянтной активности. Наиболее важным фактом является то, что скорость аутодеградации повышается с повышением концентрации активированного протеина С в растворе. При промышленном производстве не эффективно вести процессы очистки больших количеств продукта при очень низких концентрациях протеина. Так как промышленное и фармацевтическое применение получения активированного протеина С требует обработки молекул при концентрациях, значительно превосходящи х 50 мкг, настоящее изобретение позволяет специалистам получать большие количества продук та без существенной потери активности продук та. Композиции настояще го изобретения позволяют хранить стабильные растворы активированного протеина С в течение более длительного промежутка времени, нежели те, которые были известны специалистам ранее. Специалистам должно быть ясно, что способы настояще го изобретения позволяют пользователям получать большие объемы активированного протеина С с более высокими концентрациями, нежели те, которые можно было получать ранее, без опасности потерь продук та за счет аутодеградации. Кроме того, стабильные фармацевтические композиции настояще го изобретения можно легко использовать для лечения пациентов, страдающи х заболеваниями в соответствии с указаниями Taylor, Jr. et. al. в патенте США № 5009889, данные которого включены сюда по ссылке. Далее приводятся примеры, как средство иллюстрации настояще го изобретения, и они ни коим образом не ограничивают это изобретение. Пример 1. Получение человеческого протеина С. Рекомбинантный человеческий протеин С (гНРС) получают в клетках 293 человеческой почки способами, хорошо известными специалистам, например, способом Yan патент США 4981952 (включен в качестве ссылки). Ген, кодирующий че ловеческий протеин С раскрыт и в заявке Bang et al., патент США 4775624 (включен в качестве ссылки). Плазмида, которую используют для экспрессии человеческого протеина С в клетки 293, представляет собой плазмиду pLPC, которая раскрыта Bang et. al. в патенте США 4992373. Конструирование плазмиды pLPC раскрыто также в Европейской патентной публикации № 0445939 и у Grinnell et. al. 1987 Bio/Technology 5:1189-1192 (включены в качестве ссылки). Короче, плазмиду трансфектируют в клетки 293, затем стабильные трансфор манты идентифицируют, субкультивируют и выращи вают на среде не содержащей сыворотки. После фермента ции микрофильтрацией получают не содержащую клеток среду. Человеческий протеин С выдяляют из культуральной жидкости, адаптируя методики Yan, патент США 4981952. Очищенную среду доводят до 4 мМ в ЕДТА перед тем, как абсорбируют на анионнообменной смоле (Fast-Flow Q, Pharmacia). После промывки 4 объемами колонки 20 мМ Tris 200 мМ NaCl рН 7,4 и 2 объемами колонки 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, рН 7,4, связанный зимоген рекомбинантной человеческого протеина С элюируют 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 10 мМ СаCl2, рН 7,4. Элюированный протеин оказывается более 95% чистоты после элюирования по данным электрофореза в SDS – полиакриламидном геле. Дальнейшую очистку протеина осуществляют, получая 3М в NaCl протеин с последующей адсорбцией на смоле с гидрофобным взаимодействием (Toyopear 1 Pheny 1 650 M, Toso Haas), уравновешенной в 20 мМ Tris, 3 М NaCl, 10 мМ CaCl2, рН 7,4. После промывки 2 объемами уравновеши вающим буфером колонки без CaCl2, рекомбинантный человеческий протеин С элюируют 20 мМ Tris, рН 7,4. Элюированный протеин подготавливают для актива ции, удаляя остатки кальция. Реакомбинантный человеческий протеин С 3 39178 пропускают через металлическую афин ную колонку (Chelex-100, Bio-Rad) для удаления кальция, и снова свя зывают на анионнообменнике (Fast Flow Q, Pharmacia). Обе эти колонки уста навливают в серию и уравновешивают 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl, 5 мМ ЕДТА, рН 7,4. После загрузки протеина колонку Chelex-100 промывают одним объемом колонки того же самого буфера, перед тем, как колонки разъединяют. Анионнообменную колонку промывают 3 объемами уравновешивающе го буфе ра перед тем, как элюируют протеин 0,4М NaCl, 20 мМ Tris-ацетата, рН 6,5. Концентрации протеина в растворах рекомбинантного человеческого протеина С и рекомбинантного активированного протеина С определяют по коэффициенту экстинкции на 280 нм (УФ). Е0,1% = 1,85 или 1,95, соответственно. Пример 2. Активи рование рекомбинантного че ловеческого протеина С. Бычий тромбин соединяют с активированной СН-сефарозой 4В (Pharmacia) в присутствии 50 мМ НЕРЕS, рН 7,5 при 4 оС. Реакцию сочета ния ведут на смоле уже помещенной в колонку, используя примерно 5000 ед. тромбина на мл смолы. Раствор тромбина циркулирует через колонку в течение примерно 3 часов перед тем, как добавляют МЕА до концентрации 0,6 мл/л циркулирующе го раство ра. МЕА-со держащий раствор циркулирует еще 10–12 часов для того, чтобы обеспечить полную блокаду непрореагировавших аминов на смоле. После блокирования смолу с присоединенным тромбином промывают 10 объемами колонки 1М NaCl 20мМ Tris, рН 6,5 для уда ления всего неспецифически связанного протеина, и используют в реакциях активации после уравновешивания акти вационным буфе ром. Очищенный гНРС доводят до 5 мМ в ЕДТА / для хелатирования (всего оставше гося кальция) и разбавляют до концентрации 2 мг/мл 20 мМ Tris, рН 7,4 или 20 мМ Tris-ацетата, рН 6,5. Этот материал пропускают через тромбиновую колонку, уравновешенную при 37оС 50 мМ NaCl и либо 20 мМ Tris рН 7,4, либо 20 мМ Tris-ацетата, рН 6,5. Скорость потока устанавливают такой, чтобы обеспечить примерно 20 минутное контактирование между гНРС и тромбиновой смолой. Выхо дящую жидкость собирают, и немедленно проводят анализ на амидолитическую активность. Если материал не обладает специфической активностью (амидолитической) по сравнению со стандартом аРС, его рециклизуют в тромбиновую колонку для активации гНРС до заверше ния. После этого проводят разбавление 1:1 материала 20 мМ буфе ра (указанного ранее) с рН либо 7,4, ли бо 6,5 для поддержания аРС при низких концентрациях, пока ожидаются следующие ста дии обработки. Удаление выще лоченного тромбина из материала аРС завершают связывая аРС с анионообменной смолой (Fast Flow Q, Pharmacia) уравновешенной в акти вационном буфе ре (либо 20 мМ Tris, рН 7,4, либо 20 мМ Tris-ацетат, рН 6,5) 150 мМ NaCl. Тромбин не взаимодействует с анионообменной смолой в этих условиях, но происходит через колонку в выте кающий образец. После того, как аРС загружают в колонку, ее промывают 2–6 объемами 20 мМ уравновешивающего буфе ра перед элюирова нием связанного аРС, со стадией элюирования, используя 0,4 М NaCl либо в 5 мМ Tris-ацетате, рН 6,5, ли бо в 20 мМ Tris, рН 7,4. Большие объемы промывок облегчают более полное удаление додекапептида. Этот материал элюируют из колонки, и хранят либо в замороженном растворе (–20оС), либо в виде липофилизированного порошка. Амидолити ческую активность (Au) аРС определяют по высвобождению р-нитроанилида из синте тического субстрата Н-D-Phe-Pip-Arg-p-нитроанилида (S-2238), поставляемого Kabi Vitrum, с использованием Вескман Du-7400 спектрофотометра. Одну единицу активи рованного протеина С определяют как количество энзима, необхо димое для высвобождения 1 мкмоля р-нитроанилина за 1 минуту при 25оС, рН 7,4, используя коэффи циент экстинкции для р-нитроанилина на 405 нм 9620 М–1 см –1 . Ан тикоагуляционную активность активированного протеина С определяют, измеряя пролонгирование времени свертывания в анализе на время свертывания частично активированного тромбопластина (АРТТ). Стандартную кривую получают при разбавлении буфером (1 мг/мл BSA степени чистоты для радиоиммуноанализа, 20 мМ Tris, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 0,02% NaN3) в интервале концентраций протеина С от 125 до 1000 нг/мл, когда образцы приготавливают для нескольких разбавлений в этом интервале концентраций. В каждую кювету с образцами добавляют 50 мкл холодной лошадиной плазмы и 50 мкл восстановленного частично активированного тромбопластинового временного реагента (АРТТ реагент, Сигма), и инкубируют при 37оС в течение 5 минут. После инкубирования в каждую кювету добавляют 50 мкл соответствующе го образца или стандарты. Буфер разбавления используют вместо образца или стандарта для определения основного времени свертывания. Таймер фиброметра /CoA Screener Hemostasis Anlyzer, American Labor включают сразу после добавления 50 мкл 37оС 30 мМ СaCl2 к каждому образцу или стандарту. Концентрацию акти вированного протеина С в образцах рассчитывают из уравнения линейной регрессии стандартной кривой. Указанные времена свертывания представляют собой среднее из минимум трех повторов, включая и кривые для стандартов. Для получения образцов для сравнительных измерений, полной аутодеградации аРС /7,3 мг/мл в 20 мМ Tris, 150 мМ NaCl достигают спустя 44 часа инкубирования при 25оС или после концентрирования на анионообменной (FFQ, Pharmacia) рН 7,4 при 4оС. Анализы на амидолити ческую активность, HPLC (ВЭЖХ), N-те минальное секвенирование и SDS-PAGE осуществляют на образцах для подтверждения и количественного определения степени ауто деградации и сайтов расщепления аминокислотной последовательности. Пример 3. Анализы стабилизации активированного протеина С. Влияние рН на активность аРС определяют, контролируя Au. Для определения рН условий в интервале 6–9,3 (с 0,3 рН инкремента ми) используют три буферные системы, используя 50 мМ каждого из MES (рН 5,5–7), HEPES (рН 6,8–8,2), и 4 39178 CHES (рН 8,6–10). АРС разбавляют до конечной концентрации 0,4 мг/мл соответствующим рН буфе ром и инкубируют при этой концентрации перед измерением активности. Образцыоценивают вначале и спустя 30 часов при 4оС, используя амидолитические анализы при инкубационных рН. Эти измерения показывают колоколообразную рН зависимость амидолитической активности. Результа ты этих анализов приводятся далее в таблице 1. Таблица 1 Скорее ЕАК фрагмент должен оставаться достаточно связанным с остальной аРС тяжелой цепью для сохранения функциональности серинпротеазы. Если оно и существует, то бо лее высокое содержание ЕАК фрагмента связано с более высокой амидолитической активностью. ЕАК фрагмент содержит активный сайт серина (остаток 360) каталити ческой триады (включая His 211 и Asp 257, находящиеся в N-терминальной части тяжелой цепи). Поэтому, если ЕАК фрагмент ковалентно не связан с остальной частью тяжелой цепи, его протеолитический разрыв может привести к снижению энзиматической активности. Что бы определить влияние различных количеств ЕАК на антикоагулянтную активность, несколько различных порций аРС приготавливают по способу примеров 1 и 2. Амидолитические анализы проводят для концентраций субстратов в интервале 22–198 мкМ № S-2238, АРС концентраций в интервале 1,6–3,3 мМ (75–150 г/мл), 20 мМ Tris, рН 7,4, 150 мМ NaCl. Результа ты этого анализа приведены далее в таблице 2. Таблица 2 Процент содержания ЕАК в зависимости от специфи ческой активности, определенной по амидолитической и анти коагулянтной активности Амидолитические активности (YU) мг аPG рН 0 часов 30 часов 6,0 1,63 1,58 6,6 4,00 4,63 7,2 9,16 6,68 7,8 11,26 9,26 8,4 7,05 5,16 9,0 3,53 3,53 Максимальная активность для аРС составляет 7,4, тогда как экстремальные значения рН 6 и 9,3 дают существенно сниженную активность. Хотя аРС, по-видимому, сохраняет некоторую амидолити ческую активность при экстремальных значениях рН, эти данные дают возможность предположить, что а утодеградация снижается, если избежать таких условий, при кото рых аРС имеет максимальную активность. Для того, чтобы определить, является ли рН зависимость амидолитической активности функцией образования ЕАК фрагмента, аРС образцы инкубируют при рН 6,0, 7,5 и 9,0, 1,5 мг/мл при 4оС в течение 18 часов. Количество образующе гося ЕАК определяют, интегрируя площадь под ЕАК ВЭЖХ пиком, а также качественно оценивая ЕАК полосу в SDSPAGE. Эти данные свидетельствуют о том, что не происходит увеличения ЕАК образования в процессе инкубирования при рН 6,0, тогда как наблюдается примерно 30% возрастание при рН 7,5 и 50% при рН 9,0. Несмотря на повышенные уровни образования ЕАК фрагмента в образцах с рН 7,5 и 9,0, препараты все еще обладают высокой Au активностью при оценке при рН 7,4. Таким образом, образование ЕАК фрагмента нет необходимости связывать с потерей амидолитической активности. № образца Специфическая активность % ЕАК Au/мг АРТТ/мг 1 3 1,13 2,11 2 19 1,35 1,7 3 35 1,52 1,37 4 51 1,64 1,00 5 67 1,68 0,78 рН зависимость деградации используют для получения аРС образцов, кото рые содержат различные количества ЕАК. Эти образцы получают по способам примеров 1 и 2. Образцы с различным содержанием ЕАК фрагмента сравнивают с интактным аРС (менее 3% ЕАК фрагмента). Амидолити ческие кинети ческие характеристики включая Км, Ксат и Vмах зна чения определяют для каждой из этих порций для трех различных концентраций энзимов, и результаты суммированы в таблице 3. Таблица 3 Кинетическая характеристика № образца (% ЕАК) [аРС] нг/мл Км (мМ) Vмах (uмоль)/мл/мин Ксат (1/сек) 1(20%) 150 0,12 9102 7 1 113 0,12 8634 6,6 1 75 0,19 8713 6,7 2(67%) 150 0,18 10672 8,2 2 113 0,18 9729 7,5 2 75 0,18 9930 7,6 3(100%) 150 0,16 13142 10,1 3 113 0,14 2337 1,8 3 75 0,18 316 0,2 5 39178 Значения Км для трех аРС образцов, по-видимому, одинаковы (в пределах ошибки эксперимента) и дают среднее значение 0,16 мМ субстрата. Это предполагает, что а финность для S-2238 субстрата не нарушается при деградации аРС. Неожиданно сказалось, что деградированный материал все еще обладает Au активностью, практически аналогичной активности интактного аРС. Активи рованный протеин С может иметь интактную амидолитическую функциональность от трипептидного субстрата (№ S-2238) даже при высоком содержании ЕАК фрагмента. Ин витро антикоагуляционную активность можно определить в АРТТ анализе. Неожиданно сказалось, что высокая Аu активность не коррелирует с антикоакгуляционной активностью. Тогда как Au активность возрастает с увеличением содержания ЕАК, АРТТ активность снижается с увеличением содержания ЕАК. уровнях и концентрациях соли, затем измеряя процент образования ЕАК фрагмента в час. Концентрации протеина С в анализе были 4–5 мг/мл. Все анализы проводят в 5–20 мМ фосфатном буфе ре. В качестве со ли используют хло рид натрия (если присутствует соль), и все анализы проводят при 25оС. Процент образования ЕАК фрагмента в час определяют, ин тегрируя ВЭЖХ. Результа ты этих анализов представлены далее в таблице 4. Таблица 4 Влияние концентрации соли на образование фрагмента ЕАК рН % ЕАК образования /час 6,4 400 мМ 0,094 7,0 400 мМ 0,145 6,4 50 мМ 0,292 7,0 50 мМ 0,365 6,4 0 0,038 7,0 Влияние солевой концентрации на образование ЕАК фрагмента и стабильность активированного протеина С изучали, инкубируя образцы активированного протеина С при различных рН Концентрация соли 0 0,092 Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03 6 39178 7