Спосіб одержання чужорідного протеїну в клітинах е.соli, плазмідний вектор і трансформований штам e. coli для експресії чужорідного протеїну

1 Способ получения чужеродного протеина в клетках Е coh, которые трансформированы с помощью плазмиды, несущей чужеродный ген с индуцируемым промотором путем ферментации высокой плотности клеток через порционную стадию и стадию порционной подпитки без какого-либо ограничения роста за счет субстратов или метаболических побочных продуктов, и выделения и очистки экспрессируемого протеина из культуральной среды, причем концентрацию субстратов в порционной фазе подпитки регулируют и/или контролируют с помощью непрерывно действующей автоматической или полуавтоматической системы анализа и добавления, отличающийся тем, что в порционной фазе подпитки (і) концентрацию источника углерода в среде поддерживают постоянной в диапазоне от 0,1 г/л до 25 г/л при сохранении нелимитированного роста клеток (м- = м. та х). 00 продуцирование чужеродного протеина начинают в указанной порционной фазе подпитки при плот ности клеток от 10 до 80 г/л путем индукции промотора, и (ш) после осуществленной индукции синтеза продукта непрерывно добавляют источники азота и фосфата, а также соли микроэлементов, причем (iv) в течение всей порционной фазы подпитки путем соответствующего введения кислорода в ферментационный бульон величину парциального давления кислорода рОг устанавливают между 5 и 25% 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что концентрацию источника углерода во время порционной фазы подпитки поддерживают постоянной в диапазоне от 1 до 3 г/л 3 Способ по пп 1 или 2, отличающийся тем, что азот, фосфат и микроэлементы добавляют при плотности клеток 50-80 г/л 4 Способ по любому из пп 1-3, отличающийся тем, что плотность клеток согласно фазе (м) по п 1 составляет 20-60 г/л 5 Способ по любому из пп 1-4, отличающийся тем, что в порционной фазе подпитки достигают плотностей клеток между 100 и 150 г/л 6 Способ по любому из пп 1-5, отличающийся тем, что используют вектор экспрессии, включающий кассету экспрессии, которая содержит чужеродный ген, фланкированный двумя терминаторными последовательностями 7 Способ по п 6, отличающийся тем, что используемый вектор экспрессии дополнительно содержит суицидную систему 8 Способ по п 7, отличающийся тем, что используемый вектор експрессии дополнительно содержит hok-sok-суицидную систему 9 Способ по любому из пп 6-8, отличающийся тем, что используют чужеродный ген, кодирующий фрагмент антитела 10 Способ по п 9, отличающийся тем, что используют чужеродный ген, кодирующий фрагмент мини-антитела 11 Способ по любому из пп 1-4, отличающийся тем, что используют вектор экспрессии по одному из пп 14-19 12 Способ по любому из пп 1-11, отличающийся тем, что используют штамм Е coh, который в течение фазы ферментации аккумулирует не более чем 5 г/л ацетата в культуральной среде О (О (О О (О 61066 13 Способ по п 12, отличающийся тем, что ис16 Вектор по п 15, отличающийся тем, что он пользуют Е coll штамм RV308 (АТСС 31608) дополнительно содержит последовательность hok-sok-суицидной системы 14 Вектор экспрессии Е сої і, пригодный для эксп17 Вектор по любому из пп 14-16, отличающийрессии чужеродных протеинов в условиях фермеся тем, что терминаторной последовательностью нтации высокой плотности клеток, отличающийся в проксимальном положении (upstream) является тем, что он обладает следующими признаками thp и терминаторной последовательностью в дис(і) терминаторная последовательность в прокситальном положении (downstream) является t|_pp мальном положении (upstream) и терминаторная последовательность в дистальном положении 18 Вектор по любому из пп 14-17, отличающий(downstream) , ся тем, что чужеродный ген содержит последовательность, кодирующую VH- И VL-ЦЄПЬ мини(іі) система Іас-промотор/оператор антитела (IN) последовательность Шайн-Дальгарно T7g10, (iv) сигнальная последовательность pel В или 19 Вектор экспрессии, обозначаемый как рНКК, ompA, согласно схеме конструкции фиг 2 (v) последовательность чужеродного гена 20 Трансформированный Е СОІІ-ХОЗЯИН 15 Вектор по п 14, отличающийся тем, что он RV308[pHKK] для экспрессии, полученный путем дополнительно содержит суицидную систему трансформации RV308 (АТСС 31608) с помощью вектора экспрессии по п 17 Изобретение относится к способу порционной ферментации с подпиткой при использовании специальных систем хозяин-вектор ДНК для эффективного образования рекомбинантных протеинов, в особенности рекомбинантных молекул антител, в частности, фрагментов антител, как, например, миниантитела В предлагаемых согласно изобретению условиях клетки Е coli могут расти с максимальной удельной скоростью роста вплоть до очень высоких плотностей клеток После начала образования рекомбинантного продукта только образовавшийся продукт действует ограничивающе на рост ограничения роста за счет субстрата' или метаболических побочных продуктов не происходит Таким образом и в связи со специально приспособленными для этой цели и обладающими высокой стабильностью новыми векторами экспрессии можно достигать высоких выходов в единицу времени и на единицу объема рекомбинантных протеинов, которые, в частности, в случае фрагментов антител обладают высокой биологической активностью Существенной предпосылкой для эффективного образования рекомбинантных протеинов является культивирование клеток Е coli до высоких плотностей клеток Для этой цели существуют следующие, согласно уровню техники, способы культивирования после неограниченного роста (и = Umax) в порционной фазе (Batch-Phase) в последующей фазе периодической подпитки (Fed-BatchPhase) источник углерода обычно (глюкозу или глицерин) добавляют в таком ограниченном количестве, что избегают образования тормозящих рост побочных продуктов, как, например, ацетат, с тем последствием, чтобы рост тогда мог продолжаться вплоть до достижения высоких плотностей клеток, лимитируемый только субстратом (и 80г/л сенсор не апробирован Как показывает опыт, обрастания in situ-зондов с помощью Е coh в условиях очень высоких плотностей клеток могут приводить в значительной степени к дальнейшим ошибочным значениям Кроме того/ сенсор во время процесса протекания ферментации точно не рекалибруется Другие способы базируются не на измерениях с помощью in situceHcopa, а основываются, например, на определении источников углерода с помощью анализаторов ввода в потоке (FIA) или в процессе высокоэффективной жидкостной хроматографии в освобожденном от клеток культуральном растворе, который полунепрерывно отбирают из ферментера и подвергают фильтрации или микроцентрифугированию (Kleman и др , Appl ' Environ Microbiol , 57, 910-917 и 918-923 (1991), Turner и др , Biotechnol Bioeng, 44, 819829 (1994)) Предсказанные и обратносвязанные контрольные алгоритмы прогнозирования уменьшают колебания концентрации глюкозы при росте вплоть до X = 65 г/л (Kleman и др , Appl Environ Microbiol, 57, 910-917 (1991)) В области очень высоких плотностей клеток (начиная примерно с 80г/л до 150г/л) разделение клеток и питательного раствора становится в возрастающей степени более затруднительным и требующим больших затрат времени, так что также в зависимости от биомассы в ферментере увеличивается задержка во времени определения действительного содержания глюкозы и затрудняется, соответственно, становится невозможным поддерживание постоянным уровня глюкозы В противоположность этому, с постоянной и кратковременной задержкой по времени определяют концентрацию глюкозы в аппаратуре, для использования которой не нужно осуществлять этого отделения клеток (Pfaff и др , Proceedings of the 6th International Conference on Computer Appl in Biotechnol GarmischPartenkirchen, ФРГ, 1995, с 6-11} Согласно Пфаффу и др , в непосредственной близости от места отбора проб после разбавления культуры ингибитором роста используют FIA с ферментативноампериометрическим сенсором глюкозы При аэробном культивировании образуются клетки Е coh, которых не принуждают к субстратлимитируемому росту путем режимов дозировки, обычно усиливает это метаболический побочный продукт ацетат (Riesenberg, Curr Opinion Biotechnol , 2, 380-384 (1991)), который аккумулируется в питательном растворе и в повышенных количест 61066 вах действует как ингибитор роста (Pan и др , Biotechnol Lett, 2, 89-94 (1987)) Поэтому до сих пор эти порционные культивирования с подпиткой до высоких плотностей клеток были возможны только при использовании особых штаммов Е coh, в случае которых аккумуляция ацетата снижена за счет целенаправленных генетических изменений, при допустимости других, связанных с этим недостатков К потомкам Е, coh K12 относятся фосэфотрансацетилазаотрицательные мутанты (Bauer и др , Appl Environ Microbiol , 56, 1296-1302 (1990), Hahm и др, Appl Microbiol Biotechnol, 42, 100107 (1994)}, рост которых, однако, в среде глюкозаминеральные соли сильно уменьшен Phelps и др (см выше) в качестве хозяина использовали штамм Е coh TOPP5 для не лимитируемого субстратом культивирования вплоть до получения биомассы X = 85г/л Этот штамм Е coh , который очевидно не сильно аккумулирует ацетат, однако, не является никаким штаммом К12 Е, coh TOPP5 образует гемолизин и таким образом представляет собой патогенный штамм, который по соображениям безопасности не используют в промышленном секторе в качестве хозяина для образования рекомбинантных ДНК-продуктов Путем трансформации клеток Е coh с помощью плазмиды, которая содержит ген для кодирования ацетолактатсинтазы (ALS), благодаря достигнутой переориентации промежуточного обмена веществ можно достичь восстановления аккумуляции ацетата (San и др , Ann-N-Y-Acad-Sci , 721, 257-267 (1994)) Этому образу действий, однако, присущ недостаток, заключающийся в том, что при использовании ALS-кодирующей плазмиды в сочетании со второй, несущей "производственный" ген плазмидой в условиях высокой плотности клеток обычно появляются нестабильности За счет нестабильностей плазмид, которые в особенности проявляются усиленно при культивировании до очень высоких плотностей клеток, зачастую снижается эффективность образований рекомбинантных продуктов Антитела или фрагменты антител, как Fab', F(ab')2, миниантитела или одноцепочечные Fv, в возрастающей степени приобретают значение в области медицины и биотехнологии Под миниантителом нужно понимать, далее, согласно изобретению, бивалентный или биспецифический, связанный через псевдошарнирную область одноцепочечный Руфрагмент При этом, как, например, в терапии раковых заболеваний, может оказаться важной доступность иметь в распоряжении большие количества антител (примерно 1г на дозу) В Е coh в настоящее время можно особенно легко и успешно получать моновалентные фрагменты антител или слитые протеины из них, соответственно, их мультимерные или мультиспецифические варианты Эти фрагменты, соответственно, варианты, имеют маленький размер, связанный с высокой специфической способностью связывания (например, Pluckthun A, Immunol' Rev , 130, 151-188 (1992), Pack и др , J Мої Biol , 246, 28-34 (1995)) Протеины и, в частности, антитела, однако, должны иметь соответствующую складчатую структуру, - чтобы быть биологически и функционально эффективными Эту проблему 61066 нужно принимать во внимание в случае рассмотрения выхода образовавшегося фрагмента антитела на клетку в связи с плотностью клеток Далее, первичная последовательность антитела играет важную роль при определении выхода 1л vitro и складчатости in vivo (Knappik А и Pluckthun А , Protein Engm , 8, 81-89 (1995)) Так, например» Fab-фрагменты экспрессируются в виде нерастворимых цитоплазматических или периплазматических агрегатов и in vitro возвращаются в складки Так, сообщается о выходах нерастворимых антител примерно от 0,14г/л в случае низкой плотности клеток (Condra и др , J Biol Chem , 265, 2292-2295 (1990)) и ВПЛОТЬ ДО примерно 12 г/л при средней ПЛОТНОСТИ клеток (Shibui и др, Appl Microbiol Biotechnol , 38, 770-775 (1993)) Также бивалентные миниантитела (Pack и др , Biotechnol , 11, 1271-1277 (1993)) можно получать в Е сом в биологическифункциональной форме с выходами примерно 0,2г/л В случае этих выходов в среднем надлежащим образом возвращаются в складки примерно 545% 8 Целью изобретения, таким образом является разработка способа получения чужеродных протеинов, в частности, фрагментов антител, в рекомбинантных клетках Е coli в условиях высокой плотности клеток (HCDC = культивирование в условиях высокой плотности клеток) с высокими выходами в единицу времени на единицу объема и без существенного ухудшения роста за счет субстратов или метаболитов и без заметных потерь плазмид, соответственно, за счет нестабільностей плазмид, при обеспечении высокого процента эффективной биологической активности (способность связывания, корректная укладка) экспрессированного протеина В известных Е, coli системах образование чужеродного протеина начинается, как правило, пригодным образом после достижения соответствующих плотностей клеток согласно системе экспрессии благодаря регулируемой промоторной системе В этом случае, например, нужно назвать (і) araBAD-промотор в присутствии АгаСрепрессора (индуцируемый арабинозой) (например, Better и др, Ргос Natl Acad Sci (USA), 90, 457-461 (1993)), (м) рпоАпромотор (индуцируемый за счет удаления фосфата) (например, Carter и др, Biotechnol, 10, 163167 (1992)) и (ш) Іаспромоторную систему (индуцируемую с помощью изопропилтиогалактозида [IPTG]) (Pack и др , 1993г, цитировано выше) Lac-Система, которая, как правило, вызывает успешную экспрессию, однако, обладает тем недостатком, что, с одной стороны, может происходить нежелательная основная экспрессия до индукции промотора и, с другой стороны, может наблюдаться нестабильность плазмиды после индукции с помощью изопропилтиогалактозида (IPTG) Предлагаемый согласно изобретению способ представляет собой многостадийный порционный способ, который, в первую очередь, характеризуется тем, что клетки в течение всей порции могут максимально расти (ц = ц т а х ) - Так, с помощью описываемого способа в конце концов можно достигать плотности клеток 100150 г/л (в расчете на сухую биомассу) Рост также незначительно ингибируется путем аккумуляции ацетата, т к эта аккумуляция при выбранных условиях неожиданно не особенно выражена, в частности, при использовании штаммов Е coli, которые и без того склонны только к уменьшенному образованию ацетата во время ферментации Это достигается также при ряде других дополнительных мер прежде всего благодаря тому, что в порционной фазе подпитки, заключающей порционную фазу, концентрация источника углерода в среде поддерживается постоянной в определенном диапазоне значений при сохранении неограниченного роста клеток Благодаря соответствующей форме соответствующего вектора экспрессии также можно почти исключить нежелательную основную экспрессию протеина до начала синтеза протеина за счет регулируемой промоторной системы, точно так же, как отчасти значительную потерю плазмиды, которая, как уже было упомянуто выше, должна обычно наблюдаться в системах экспрессии при использовании сильных промоторов, как, например, Іас-промоторная система В особой форме выполнения изобретения описывается специальный вектор (рНКК), который в качестве чужеродного гена содержит последовательности, кодирующие фрагменты мышиного, соответственного, гуманизированного антитела МАЬ 425 МАЬ 425 (АТСС НВ 9629) представляет собой мышиное моноклональное антитело, которое выделено из известной человеческой линии раковых клеток А432 (АТСС CRL 1555) и связано с эпитопом человеческого рецептора эпидермального фактора роста (EGFR, гликопротеин величиной примерно 170 кил од ал ьто но в) при ингибировании связи природного лиганда эпидермального фактора роста (EGF) Было установлено, что МАЬ 425 оказывает цитотоксическое действие на опухолевые клетки, соответственно, может препятствовать их росту (Rodeck и др , Cancer Res , 47, 3692 (1987)) Из международной заявки WO 92/15683 известны гуманизированные, а также химерные формы МАЬ 425, включая последовательности ДНК и аминокислотные последовательности их легких и тяжелых цепей В среднем можно достигать выходов протеина от 3 до 5г/л спустя примерно от 25 до 35 часов протекания всего процесса культивирования В случае особенно критических из-за их критериев складчатости фрагментов антител, в особенности миниантител, примерно 80% синтезированного материала биологически активно и имеет корректную складчатую структуру Таким образом, предметом изобретения является способ получения чужеродного протеина в клетках Е coli, которые трансформируются с помощью чужеродного гена и несущей индуцируемый промотор плазмиды, путем ферментации в условиях высокой плотности клеток через стадии порций и порционной подпитки без всякого ограничения роста благодаря субстратам или метаболическим побочным продуктам, и выделения и очистки экспрессированного протеина из культуральной среды, причем концентрацию на субстратах в фазе порционной подпитки направляют с помощью непрерывно действующей автоматической или полуавтоматической системы анализа 61066 10 и добавления, причем в фазе порционной подпитначала за счет , промоторной системы Особенно ки (і) концентрация источника углерода в среде пригоден терминатор thP (Nohno и др , J Bactenol , поддерживается постоянной в диапазоне от 0,1 г/л 170, 4097-4102 (1988)), однако, также можно исдо 25г/л при сохранении неограниченного роста пользовать другие известные терминаторные последовательности КЛеТОК (|J = [Jmax), О О ПрОДуЦИрОВЭНИе ЧужерОДНОГО протеина начинается в указанной фазе порционДалее, предметом изобретения является споной подпитки при плотности клеток от 10 до 80г/л соб, при котором используемый вектор экспрессии за счет индукции промотора, и (ш) после осущестдополнительно содержит суицидную систему вленной индукции синтеза продукта непрерывно Суицидная система продуцирует протеин, который добавляют используемые азот и фосфат, а также без наличия плазмиды в клетке токсичен для нее соли микроэлементов, причем (iv) во время всей Пригодные суицидные системы известны из литефазы порционной подпитки путем соответствуюратуры Особенно пригодной, согласно изобретещего введения кислорода в ферментационный нию, суицидной системой является покБоксистема бульон величину парциального давления кисло(например, Gerdes К, Biotechnol , 6, 1402-1405 рода рОг устанавливают равной 525% (1988)) Для способа в целях эффективного образования рекомбинантных протеинов, в особенноПредлагаемая согласно изобретению величисти молекул антител, особенно важным является на необходимой концентрации источника углерода то, что система хозяинвектор ДНК в области высов течение порционной фазы подпитки составляет кой плотности клеток характеризуется высокой от 0,1 до 25 г/л, предпочтительно от 0,5 до 15г/л, в плазмидной стабильностью, незначительной реособенности от 1,0 до 5г/л, соответственно, от 1,0 комбинантной основной экспрессией и высоким до Зг/л Особенно предпочтительная концентраобразованием продукта Суицидные системы в ция составляет 1,5г/л В качестве источника углесочетании с рекомбинантными, фланкированными рода нужно назвать предпочтительно глюкозу или с помощью терминаторов экспрессирующими клаглицерин или смеси обоих Согласно изобретестерами при этом являются специфичными для нию, добавление источника углерода осуществвектора ляют непрерывно на входе (online) с помощью автоматической или полуавтоматической системы Далее, предметом изобретения является содобавления и анализа Предпочтительно испольответствующий способ, при котором используют зуют систему анализа инъекционного потока на чужеродный ген, который кодирует фрагмент анвходе (FIA) титела, в частности, миниантитело Добавление используемого азота, предпочтиДалее, предметом изобретения является спотельно аммонийного азота, и фосфата, например, соб, при котором используют вектор экспрессии с диаммониигидрофосфата или аммонийдигидродополнительными, описываемыми ниже признафосфата, а также микроэлементов, например, ками В принципе можно использовать большинрастворимых в среде солей бора, марганца, меди, ство известных, пригодных для технологии рекоммолибдена и кобальта, железа или цинка, осущебинации и для продуцирования в промышленном ствляют в порционной фазе подпитки, заключаюмасштабе штаммы Е coll Более предпочтительно щей порционную фазу, предпочтительно после находят применение такие штаммы, которые при включения синтеза протеина за счет регулируеморосте до высокой плотности клеток аккумулируют го промотора при плотности клеток 5080г/л (в расотносительно немного ацетата Особенно пригодчете на сухую биомассу), предпочтительно прины штаммы, обогащение ацетатом которых сомерно при 70г/л, при общей норме роста от 100 до ставляет величину ниже 5г/л Неожиданно оказа150, предпочтительно 140г/л лось, что благодаря выбранным условиям предлагаемого согласно изобретению способа Включение синтеза протеина путем активации можно поддерживать особенно низкой аккумулярегулируемой промоторной системы осуществляцию ацетата В этом отношении особенно пригодют согласно изобретению при плотности клеток ным является общеизвестный и имеющийся в 10-80г/л, предпочтительно 20-60г/л, в высшей степродаже штамм Е coh RV308 (АТСС 31608), а пени особенно предпочтительно в диапазоне знатакже его такие же по действию варианты чений от 40 до 50г/л Парциальное давление кислорода в течение Предметом изобретения, таким образом, в порционной фазы подпитки составляет 525%, особенности, является соответствующий способ, предпочтительно 15-25%, в высшей степени осопри котором используют штамм Е coh с аккумулябенно предпочтительно 20% цией ацетата ниже 5г/л в культуральной среде во время ферментации РН-Значение ферментационной среды согласно изобретению во время всей подпитки устаПредметом изобретения, кроме того, является навливают 6,57,0, предпочтительно 6,7-6,9, в осовектор экспрессии Е coh, пригодный для экспресбенности 6,8 сии чужеродных протеинов в условиях ферментации при высокой плотности клеток, который облаПредметом изобретения, далее, является содает следующими признаками ответствующий способ, при котором используют вектор экспрессии, содержащий чужеродный ген в (і) терминаторная последовательность в провиде полигенного экспрессирующего кластера, ксимальном и дистальном направлении, фланкированного двумя терминаторными после(м) lac-про мотор/оператор - система, довательностями Эти терминаторные последова(ш) последовательность Шайн-Дальгарно Т7д тельности, в особенности позиционированные, в 10, проксимальном положении успешно предотвра(iv) pelB или ompA сигнальная последовательщают нежелательную экспрессию протеина до ность, 12 11 61066 (v) последовательность чужеродного гена, кислорода (рОг) от 100% насыщения до значения ниже 515% величину парциального давления кии в предпочтительном варианте осуществлеслорода путем контролирования скорости рОгния дополнительно включает суицидную систему, мешалки устанавливают предпочтительно при в частности, hoksok-суицидную систему значении рОг от 15 до 25%, в частности, около Согласно изобретению, промоторную систему 20% (фигЗс) Это установление (путем пропускатакже можно заменить другими пригодными, нания обогащенного чистым кислородом воздуха) пример, вышеуказанными системами Точно также нужно осуществлять спустя примерно 6-12 часов изобретение охватывает также другие, одинаково после начала ферментации основной культуры действующие сигнальные и управляемые послеКонцентрация глюкозы, которая первоначально довательности составляет предпочтительно 2035г/л, снижается В качестве специальных форм выполнения, вплоть до конца подфазы II, которая также преднаконец, предметом изобретения являются опреставляет собой конец порционной фазы, предшеделяемый своей конструкцией вектор экспрессии ствующей порционной фазе подпитки При этом рНКК (фиг 2), который содержит последовательвеличины не должны ни в коем случае быть ниже ности для миниантитела, происходящего от МАЬ 0,1 г/л Это предотвращают теперь путем соответ425, а также особый рекомбинантный Е Cohствующего добавления глюкозы (подфаза III, хозяин RV308 [рНКК] фиг За, начало фазы подпиточной дозировки) Описание фигур Согласно изобретению, поддерживают постоянФиг 1 Экспериментальная опытная конструкным содержание глюкозы между 0,1 и 25г/л, предция биореактора для получения протеинов в успочтительно, однако, при 1-Зг/л Для этой цели ловиях высокой плотности клеток Система снабможно, например, использовать подпиточную пижена измерительным устройством, индикаторным тательную среду FS1 (таблица 1) Т к эта область приспособлением, устройствами для контроля и концентрации глюкозы находится в достаточной дозировки степени выше Ко-значения для глюкозы (Bergter, Фиг 2 Оптимизированный вектор экспрессии "Рост микроорганизмов", с 41, 1983г, изд Gustav рНКК, а также отдельные участки его конструкции Fischer, Йена), клетки могут расти дальше при Вектор состоит в основном из отдельных участков U a Контроль и регулирование концентрации mx известных векторов pASK40, рАКЮО и pKG1022 глюкозы согласно изобретению осуществляют с Фиг 3 (a-d) Культивирование при высокой помощью автоматической или полуавтоматичеплотности клеток (HCD) рекомбинантной Е coll, ской системы например, Е coll RV308 [рНКК] розлив по времени биомассы, глюкозы, аммонийного азота, фосфата, Особенно пригодными являются (on-line) сисацетата, скорость мешалки, парциальное давлетемы анализа инъекционного потока в непосредние кислорода, содержание C-z и СОг в отходящем ственном производстве на входе Функционируюгазе, стабильность плазмиды (выражено в % рщие за счет чисто ручного или в значительной лактамазаположительных колоний) и образование степени ручного управления системы оказываютпротеина (здесь scFv42sdhlx) Порционная фаза и ся неблагоприятными Порционная фаза подпитки фаза порционной подпитки подразделены на 5 начинается примерно между 15-тым и 22-ым чаподфаз IPTG-Стрелка указывает старт продуцисами, однако, в конце концов зависит от различрования протеина ных индивидуальных факторов, таких как температура, состав и концентрация среды, размер В предлагаемом согласно изобретению спореактора и т д , в особенности, однако, также от собе используют трансформированные клеткирода используемого штамма Е coli Предпочтихозяева Е coli При выборе конструкций плазмид тельнее примерно спустя 4-8 часов после начала руководствуются родом экспрессированного пропорционной фазы подпитки начинают осуществтеина Особенно благоприятные признаки таких лять синтез чужеродного протеина Точный моконструкций описываются ниже Необходимые для мент времени, однако, в конечном счете выбираконструкции плазмид и трансформации клетокют по достигнутой к этому моменту плотности хозяев технологии и методы общеизвестны и подклеток культуры Плотности клеток от 10 до 80г/л, робно описываются в литературе (например, предпочтительно 20-60г/л, являются особенно Sambrook и др/ Лабораторное руководство "Моблагоприятными, если можно достигать конечных лекулярное клонирование", изд Cold, Харбор плотностей клеток от 100 до 150г/л Таким обра(1989) К тому же они представлены в примерах зом, вообще благоприятным для начала синтеза путем указания особых вариантов осуществления протеина является тот момент, когда ко времени изобретения Исходные плазмиды или части индукции имеются примерно 10-60% максимально плазмид либо имеются в продаже, либо их можно достигаемой плотности клеток сразу конструировать по стандартным способам на основе известных схем конструкции Синтез протеина вызывают за счет включения Предварительную порционную фазу Типичной согласно изобретению ферментации трансформированных клеток Е Coli подразделяют на две подфазы После инокуляции с помощью соответствующей предкультуры подфаза I характеризуется Іас-фазой, в которой клетки адаптируются и норма роста (ц) затем возрастает до ц т а х Во время подфазы II клетки растут экспоненциально при М - Мтах После падения парциального давления регулируемой промоторной системы Это включение в зависимости от используемой системы, как правило, осуществляют путем добавления вещества или за счет изменения физической величины, например, в случае предпочтительной lacсистемы (промотор, оператор, индуктор) - путем добавления изопропилтиогалактопиранозида (IPTG) Дальнейший рост клеток теперь ограничивается только еще аккумулирующимся продуктом 14 13 61066 Поэтому, согласно изобретению, важным является та Однако, аккумуляция, соответственно, конценто, что перед индукцией не может происходить трация, ацетата в среде неожиданно оказывается никакой заметной основной экспрессии, которая низкой Это также должно объясняться особыми оказывала бы неблагоприятное влияние на общий условиями способа Штаммы Е coll с максимальрост и, таким образом, на общий выход Это проным накоплением ацетата -д....«...ил mi % 0 5 - 10 15 20 25 30 35 і.. ..і • •. • 1. ••. 11 •. . 1 . . . . ; . , , . [, 1М | концентрация СЬ вотходящейгазе (%) 0 S 1 1 2 2 3 0 5 0 Б 0 3 5 |1 [ и I . . • і I . . . , I • і і . I • . • • t . . , f I [ г/л ] IT ш 20 о зоо ы зоо 1 0 то 2 3 7 t 8 - lac положительные колонии (%) 20 Ш Б О Є Н М 10 О 2 t ...-J i _ J , 1 і L__J I «— биомасса [ г/л ] 0 29 4 6 & 0 Ю *Ш 1 0 U0 2 < 1. 1. 1. 1 • t 1 ^11 1 г і і і і і і і і і en -# І re • 1 О) О) / і V ^: „ „ о 1и, „ •• У! Л ! т^ 1 го го 23 Комп'ютерна верстка О В Курасв 61066 24 Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119