Промотор il-18bp, його одержання та застосування

1. ДНК-послідовність, що кодує IL-18BPпpoмотop людини з послідовністю SEQ ID NO:1, або ії фрагмент, що включає послідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3, здатні керувати генною експресією, де послідовності додатково включають 50 нуклеотидів з 5'-кінця послідовності SEQ ID NO:5. 2. ДНК-послідовність за п. 1, яка додатково включає інтрон. 3. ДНК-послідовність за п. 2, в якій даний інтрон складається з першого інтрону IL-18ВР. 4. ДНК-послідовність за будь-яким з пп. 1-3, що додатково містить ген, приєднаний шляхом зшивання до IL-18BP-промотору. 5. ДНК-послідовність за п. 4, в якій вказаний ген кодує IL-18BP. 6. ДНК-послідовність за п. 4, в якій вказаний ген кодує гетерологічний білок. 7. ДНК-послідовність за п. 6, в якій вказаний гетерологічний ген кодує люциферазний ген. 8. ДНК-послідовність за п. 6, в якій вказаний гетерологічний ген кодує білок, вибраний з бетаінтерферону, TNF, еритропоетину, тканинного активатора плазміногена, гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора, марганець-супероксиддисмутази, імуноглобуліну або його фрагмента, 2 (19) 1 3 88601 4 21. Спосіб за п. 19, в якому вказана клітина-мішень 26. Трансгенна миша, яка має ДНК-послідовність, являє собою моноцит. що кодує ДНК-послідовність за будь-яким з пп. 1-8. 22. Спосіб за п. 19, в якому вказана клітина-мішень 27. Застосування ДНК-послідовності, яка кодує ІЕявляє собою макрофаг. 18ВР-промотор людини, з послідовністю SEQ ID 23. Спосіб за будь-яким з пп. 19-22, де представNO:1, або її фрагмента, що включає послідовність ляючий інтерес ген кодує білок, що забезпечує SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3, здатні керувати резистентність до ВІЛ-інфекції. генною експресією, де послідовності додатково 24. Застосування рекомбінантного вірусного веквключають 50 нуклеотидів з 5'-кінця послідовності тора за будь-яким з пп. 14-18 для виробництва SEQ ID NO:5, для виробництва лікарського засобу, лікарського засобу для лікування ВІЛ-інфекції, гепризначеного для лікування захворювання. мопоетичного порушення, такого як SCID, хроніч28. Фармацевтична композиція, яка включає тераного грануломатозного захворювання та таласемії певтично ефективну кількість ДНК-послідовності, і/або захворювання у індивіда, що проявляється у що кодує IL-18ВР-промотор людини, з послідовніспідвищеному рівні гамма-IFN у тканині тіла. тю SEQ ID NO:1, або її фрагмента, що включає 25. Застосування за п. 24, де лікарський засіб припослідовність SEQ ID NO:2 або SEQ ID NO:3, здазначений для лікування захворювання у індивіда, тні керувати генною експресією, де послідовності що проявляється у підвищеному рівні гамма-IFN у додатково включають 50 нуклеотидів з 5'-кінця тканині тіла, і додатково включає IL-6 і/або IRF, послідовності SEQ ID NO:5. і/або С/ЕВРβ фактори. Даний винахід відноситься до промотору білка, який зв'язує інтерлейкін-18 (IL-18BP), до його отримання і застосування. Цитокінзв'язувальні білки (розчинні цитокінові рецептори) являють собою, як правило, позаклітинні лігандзв'язувальні домени відповідних цитокінових рецепторів клітинної поверхні. Вони утворюються в результаті альтернативного сплайсингу або в результаті протеолітичного розщеплення рецептора клітинної поверхні. Ці розчинні рецептори були описані раніше: наприклад, розчинні рецептори для IL-6 і γ-IFN (Novick і співавт. 1989), TNF (Engelman і співавт. 1989 і Engelman і співавт. 1990), IL-1 і IL-4 (Malishewski і співавт. 1990) і α/βIFN (Novick і співавт. 1994, Novick і співавт. 1992). Один з цитокінзв'язувальних білків, названий остеопротегерин (OPG, відомий також як чинник інгібування остеокластів - OCIF), представник сімейства TNFR/Fas, являє собою перший приклад розчинного рецептора, який існує виключно як секретований білок (Anderson і співавт. 1997, Simonet і співавт. 1997, Yasuda і співавт. 1998). Білок, який зв'язує інтерлейкін-18 (IL-18BP), був виділений з сечі афінним очищенням на колонці з IL-18 (Novick і співавт. 1999). IL-18BP усуває IL-18-індукцію γ-IFN і IL-18-активацію NF-κΒ in vitro. Крім того, IL-18BP інгібує γ-IFN-індукцію у мишей, яким ін'єктували LPS. Ген IL-18BP розташований на 11-й хромосомі людини, і в геномній послідовності розміром 8.3 т.п.н., що включає ген IL-18BP, немає екзону, що кодує трансмембранний домен. До теперішнього часу у людини виявлено чотири ізоформи IL-18BP, що виготовляються шляхом альтернативного сплайсингу мРНК. Їх позначили IL-18BP а, b, с, і d, причому всі вони володіють одним і тим же N-кінцем і відрізняються по С-кінцю (Novick і співавт. 1999). Дані ізоформи відрізняються по здатності зв'язувати IL-18 (Kim і співавт. 2000). Відомо, що серед цих чотирьох ізоформ ІL18ВР-изоформи а і с людини (hIL-18BP) володіють здатністю нейтралізувати IL-18. Найпоширеніша IL-18ВР-ізоформа, сплайсований варіант ізоформи а, виявляє високу спорідненість до IL-18 при швидкому включенні і повільному вимкненні швид кості, і константи дисоціації (Kd), приблизно, 0,4 нМ (Кіт і співавт. 2000). IL-18BP конститутивно експресується в селезінці (Novick 1999), і циркулює в плазмі в концентрації 2,5 нг/мл (Novick і співавт. 2001). Залишки, що беруть участь у взаємодії IL-18 з IL-18ВР, описані завдяки використанню комп'ютерного моделювання (Кіш і співавт. 2000) і основані на взаємодії між аналогічним білком IL-1β з IL1R тип І (Vigers і співавт. 1997). Відповідно до моделі зв'язування IL-18 з IL-18BP, Glu-залишок в положенні 42 і Lys-залишок в положенні 89 у IL-18 ймовірно зв'язується, відповідно, з Lys-130 і Glu114 в IL-18BP (Кіт і співавт. 2000). Як відмічено, IL-18 індукує γ-IFN, який, в свою чергу, як недавно повідомлялося, індукує in vitro утворення мРНК IL-18BP (Muhl і співавт. 2000). Тому, IL-18BP міг би служити як "вимикаючий" сигнал, який термінує запальну реакцію. IL-18BP в значній мірі гомологічний сімейству білків, що кодуються у деяких поксвірусів (Novick і співавт. 1999, Xiang and Moss 1999). Інгібування IL18 за допомогою даного ймовірного вірусного IL18BP може ослабляти запальну противірусну Th1відповідь. Рівень сироваткового IL-18BP істотно підвищується при сепсисі, що свідчить про його роль в регулюванні імунних реакцій in vivo (Novick і співавт. 2001). Дійсно, IL-18BP в різних клітинах індукується за допомогою γ-IFN, і це примушує вважати, що він служить як негативний інгібітор імунної реакції, опосередкованої IL-18, по типу зворотного зв'язку (Mughl і співавт. 2000). Попередні результати свідчать про те, що мРНК IL-18BP детектується в лейкоцитах, клітинах ободової кишки, тонкого кишечнику, передміхурової залози і особливо в клітинах селезінки (Novick і співавт. 1999). До складу клітин селезінки входять макрофаги, лімфоцити, а також клітини плазми, доповнені клітинами з кровотоку. Активність елементів, які контролюють транскрипцію, промотор і енхансери, істотно варіює у різних типів клітин. Промотори і енхансери складаються з коротких ланцюжків ДНКпослідовностей, які специфічно взаємодіють з клі 5 88601 6 тинними білками, що беруть участь в транскрипції ньому в даній послідовності, при цьому дана ДНК(огляд Dynan and Tjian 1985, McKnight and Tjian послідовність може додатково містити ген, приєд1986, Sassone-Corsi and Borreli 1986 і Maniatis і наний шляхом зшивання до промотору IL-18BP. співавт. 1987). Певне сполучення різних послідовУ першому аспекті даного винаходу даний ген ностей розпізнавання і певна кількість споріднених може кодувати, наприклад, IL-18ВР або гетеролофакторів транскрипції визначає ефективність, з гічний білок, такий як люцифераза, бетаякою даний ген транскрибується в клітині конкретінтерферон, TNF, еритропоетин, тканинний актиного типу. Багато які еукаріотичні промотори місватор плазміногену, гранулоцитарний колонієститять два типи розпізнавальних послідовностей: мулюючий фактор, марганець-супероксидТАТА-бокс і розташовані лівіше елементи промодисмутазу, імуноглобулін, або його фрагмент, гортору. Ймовірно, даний ТАТА-бокс, розташований в мон росту, FSH, hCG, IL-18, hsLDLR і білки, які положенні апстрим на 25-30 п.н. від сайту ініціації зв'язують рецептор TNF. транскрипції, бере участь в управлінні РНКУ даному винаході представлені вектор, що полімеразою II, яка починає синтез РНК у відповівключає ДНК-послідовність, послідовність, що кодному сайті. На відміну від нього, розташовані в дує ІL-18ВР-промотор людини, хазяйська клітина, положенні апстрим промоторні елементи визнаяка включає даний вектор, наприклад, СНО, WISH, чають швидкість, з якої починається транскрипція. HepG2, Cos, CV-1, HeLA, і клітини Hakat U937, а Енхансерні елементи можуть стимулювати майже також спосіб отримання рекомбінантного білка, що 1000-кратне збільшення транскрипції з приєднавключає культивування відповідної хазяйської кліними гомологічним або гетерологічним промототини і виділення продукованого рекомбінантного рами. Разом з тим, на відміну від промоторних білка. елементів, розташованих в положенні апстрим, Крім того, в даному винаході представлений енхансери активні при розміщенні їх в положенні рекомбінантний вірусний вектор, який включає даунстрим від сайту ініціації транскрипції або ж на частину геному даного вірусу, фрагмент ДНК, що значній відстані від даного промотору. Багато які кодує відповідний ген і фрагмент ДНК, що включає енхансери клітинних генів функціонують тільки в ДНК-послідовність, яка кодує IL-18ВР-промотор певній тканині або в клітині певного типу (огляд людини. Більш конкретно, частина даного вірусу Voss і співавт. 1986, Maniatis і співавт. 1987). Крім може, наприклад, являти собою аденоасоційоватого, деякі енхансери стають активними лише в ний вірус, а також ретровірус, такий як HIV, HFV, специфічних умовах, які виникають в присутності MLV, FIV і VSV. індуктора, такого як гормон або іон металу (огляд У даному винаході розроблений також спосіб Sassone-Corsi and Borrelli 1986, а також Maniatis регуляції клітинноспецифічної експресії відповід1987). Через цю різницю в клітинній специфічності ного гена, що включає трансдукування клітиниклітинних енхансерів, вибір промоторних і енханмішені ссавця за допомогою вказаного вірусного серних елементів, які вводять в еукаріотичний вектора даного винаходу в клітині-мішені, такій як експресійний вектор, визначається типом клітин, в гемопоетична стовбурова клітина, а також монояких експресується даний рекомбінантний ген. З циту. Відповідний ген може, наприклад, представіншого боку, використання заздалегідь виготовлеляти білок, що додає резистентності до ВІЛного вектора, що містить специфічний промотор і інфекції. Регуляція клітинноспецифічної експресії клітинний енхансер, може дещо обмежити типи гена, що представляє інтерес, може використовуклітин, в яких можна здійснити експресію. ватися для лікування, наприклад, ВІЛ-інфекції, Багато які енхансерні елементи, отримані з віпорушень кровотворення, таких як SCID, хронічне русів, володіють більш широким колом хазяїв і гранульоматозне захворювання і таласемія. активні в різноманітних тканинах, хоча у різних Далі, в даному винаході розроблений спосіб клітинних типів спостерігаються істотні кількісні генної терапії для лікування захворювання індивівідмінності. Наприклад, ранній енхансер вірусу да з підвищеним синтезом γ-IFN в тканинах тіла, SV40 в багатьох клітинах, отриманих від різних що включає ведення ефективної кількості вірусновидів ссавців, активний по-різному, і, отже, вектого вектора даного винаходу, крім того, який необори, що включають даний енхансер, корисні для в'язково включає введення факторів IL-6 і/або αвикористання (Dijkema і співавт. 1985). Дві інші TNF, або IRF і/або C/ΕΒΡβ. комбінації енхансер/промотор, які активні у широУ іншому аспекті даний винахід відноситься до кого кола клітин, отримані з довгого повтору (LTR) трансгенних мишей, які несуть ДНК-послідовність, геному вірусу саркоми Рауса (Gorman і співавт. яка кодує ДНК-послідовність даного винаходу. 1982b) і з цитомегаловіруса людини (Boshart і спіКрім того, в даному винаході розкрите викоривавт. 1985). стання ДНК-послідовності, яка кодує IL-18ΒΡДаний винахід відноситься до ДНКпромотор людини (SEQ ID NО:1), або фрагмента послідовності, що кодує IL-18BP-промотор (SEQ ID або його функціонального похідного, де 3'-кінець NO: 1) людини, або фрагмент, такий як SEQ ID вказаної ДНК-послідовності або її фрагмент вклюNOS 2 або 3, або його функціональне похідне, в чає один або декілька нуклеотидів з 5'-кінця SEQ якому 3'-кінець вказаної ДНК-послідовності або її ID NО:5, для виробництва лікарського засобу, що фрагмент включає один або декілька нуклеотидів використовується при лікуванні захворювання. з 5'-кінця SEQ ID NО:5. У даному винаході представлена також фарТочніше, похідне, відповідно до даного винамацевтична композиція, що включає терапевтично ходу, може являти собою ДНК даного винаходу, ефективну кількість ДНК-послідовності, що кодує змінену по одному або декількох АР1-сайтах, IL-18BP-промотор людини (SEQ ID NО:1), або представлених в елементі сайленсера, присутфрагмент або його функціональне похідне, в яко 7 88601 8 му 3'-кінець вказаної ДНК-послідовності або її 18BP у контрольних мишей і у дефіцитних по IRF фрагмента включає один або декілька нуклеотидів мишей, а також індукція IL-18BP у контрольних з 5'-кінця SEQ ID NО:5. мишей є статистично значущою (р