Застосування il-1f7b, здатного зв’язуватися з il-18r та il-18bp, разом з il-18bp для лікування захворювань, асоційованих з надлишковою активністю il-18

1. Застосування IL-1F7b, здатного зв'язуватися з IL-18R і IL-18BP, разом з IL-18ВР для виробництва лікарського засобу для лікування або профілактики метастазів, вірусних інфекцій або запальних захворювань, вибраних з летальності, пов'язаної з ендотоксином (сепсису), пошкодження печінки, індукованого токсинами або активованими Т-клітинами, або гепатиту С, артриту, ушкодження легень, псоріазу, запального захворювання кишечнику, ушкодження головного мозку, ішемічного ушкодження, дисфункції серця або невриту. 2. Застосування за п. 1 для лікування або профілактики запальних захворювань, вибраних з летальності, пов'язаної з ендотоксином (сепсису), ушкодження печінки, індукованого токсинами або активованими Т-клітинами, або гепатиту С, артриту, ушкодження легень, псоріазу, запального захворювання кишечнику, ушкодження головного мозку, ішемічного ушкодження, дисфункції серця й невриту. 3. Застосування за п. 1 для профілактики утворення метастазів. 2 (19) 1 3 86750 4 Т-клітинами, або гепатиту С, артриту, ушкодження 12. Застосування за п. 11 для лікування або пролегень, псоріазу, запального захворювання кишефілактики вірусного захворювання. чнику, ушкодження головного мозку, ішемічного 13. Застосування за п. 11 для лікування або проушкодження, дисфункції серця і невриту. філактики злоякісної пухлини. Даний винахід відноситься до застосування цитокіну, здатного зв'язувати IL-18-зв'язуючий білок та інгібувати активність другого цитокіну, причому другий цитокін є членом сімейства IL-1. У 1989 р. була описана сироваткова активна речовина, індукована ендотоксином, яка індукувала інтерферон-g (IFN-g), отриманий із клітин селезінки миші [Nakamura et al., 1989]. Дана сироваткова активна речовина не діяла як агент, який напряму індукує IFN-g, а скоріше як стимулятор, що діє спільно з IL-12, IFN-a/b, TNF або мітогенами. Спроба виділити дану активність із сироватки миші після впливу ендотоксину виявила вочевидь гомогенний білок масою 50-55кДа [Nakamura et al., 1993]. Оскільки інші цитокіни можуть діяти як спільні стимулятори вироблення IFN-g, нездатність нейтралізуючих антитіл проти IL-1, IL-4, IL-5, IL-6 або TNF нейтралізувати вказану сироваткову активність передбачала, що це є іншим фактором. У 1995 р. ті ж дослідники показали, що індукований ендотоксином спільний стимулятор вироблення IFN-g присутній в екстрактах печінки мишей, попередньо підданих впливу P.acnes [Okamura et al., 1995]. На даній моделі популяція макрофагів печінки (купферівських клітин) розширюється, і для даних мишей низька доза бактеріального ліпополісахариду (LPS), яка для мишей, що не зазнавали попереднього впливу, не є летальною, стає летальною. Чинник, названий IFN-g-індукуючим фактором (IGIF) і пізніше позначений як інтерлейкін-18 (IL-18), був виділений в гомогенному стані з 1200 грамів печінки мишей, що зазнали впливу P.acnes. Вироджені олігонуклеотиди, отримані з амінокислотних послідовностей виділеного IL-18, використовували для клонування мишачої кДНК IL-18 [Okamura et al., 1995]. Матричні РНК для IL-18 та інтерлейкіну-12 (IL-12) легко виявляються в активованих макрофагах. IL-18 сам по собі не індукує IFN-g, але діє, головним чином, як спільний з мітогенами або IL-12 стимулятор. У 1996 р. було повідомлення про послідовність людської ДНК для IL-18. Інтерлейкін IL-18 має спільні структурні риси з сімейством білків IL-1 [Nakamura et al., 1993, Okamura et al., 1995, Ushio et al., 1996 і Bazan et al., 1996]. Ha відміну від більшості інших цитокінів, які мають чотириспіральну пучкову структуру, IL-18 і IL-1b мають цілком b-складчасту пластинчасту структуру [Tsutsui et al., 1996]. Подібно до IL-lb, IL18 синтезується як біологічно не активний попередник (proIL-18), що не має сигнального пептиду [Ushio et al., 1996]. Попередники IL-1b і IL-18 розщеплюються каспазою-1 (IL-ib-перетворюючим ферментом або ICE), яка розщеплює попередники після залишку аспарагінової кислоти на позиції Р1. Утворені зрілі цитокіни легко вивільняються з клітини [Ghayur et al., 1997, і Gu et al., 1997]. IL-18 являє собою спільний стимулятор вироблення цитокінів (IFN-g, IL-2 і гранулоцитарномакрофагального колонієстимулюючого фактора) клітинами Т-хелперного типу 1 (Th1) [Kohno et al., 1997], а також спільний стимулятор FASлігандопосередкованої цитотоксичності клонів натуральних мишачих клітин-кілерів [Tsutsui et al., 1996]. Лімфоцити Th1 беруть участь в імунних відповідях проти пухлин [Seki et al., 2000]. Th1 відповіді включають секрецію цитокінів IL-2, IL-12, IL-18 і IFN-g, a також дегенерацію специфічних цитотоксичних Т-лімфоцитів, які розпізнають конкретні пухлинні антигени. Th1 відповідь є також життєво важливою зброєю для захисту організму-хазяїна від багатьох мікроорганізмів. Однак, Th1 відповідь також може бути пов'язана з небажаними ефектами, такими як розвиток декількох аутоімунних захворювань, запалення і відторгнення трансплантованого органу. Цитокінзв'язувальні білки (розчинні цитокінові рецептори) звичайно являють собою позаклітинні лігандзв'язувальні домени відповідних їм цитокінових рецепторів клітинної поверхні. Вони виробляються як шляхом альтернативного сплайсингу, так і шляхом протеолітичного розщеплення рецептора клітинної поверхні. Вказані розчинні рецептори були описані раніше: наприклад, розчинні рецептори IL-6 і IFN-g [Novick et al., 1989], TNF [Engelmann et al., 1989, і Engelmann et al., 1990], IL-1 та IL-4 [Maliszewski et al., 1990], IFN-a/b [Novick et al., 1994, Novick et al., 1992]. Один цитокінзв'язувальний білок, названий остеопротегерином (OPG, відомий також як фактор інгібіції остеокластів OCIF), член сімейства TNFR/Fas, вочевидь, є першим прикладом розчинного рецептора, який існує тільки як секретований білок [Anderson et al., 1997, Simonet et al., 1997, Yasudaetal., 1998]. Інтерлейкін-18-зв'язуючий білок (IL-18BP) був виділений по спорідненості на колонці з IL-18 з сечі [Novick et al., 1999]. IL-18BP відміняє викликану IL-18 індукцію IFN-g і IL-8, активацію NF-кВ in vitro та індукцію IFN-g in vivo. IL-18BP являє собою розчинний циркулюючий білок, який конститутивно експресується в селезінці, і належить до суперсімейства імуноглобулінів. Найбільш широко поширена ізоформа IL-18BP, сплайсована варіантна ізоформа а, має високу спорідненість з IL-18 з швидкою швидкістю включення і повільною швидкістю виключення і константою дисоціації (Kd) приблизно 400пМ [Kim et al., 1999]. Залишки, що беруть участь по взаємодії IL-18 і IL-18BP, були описані за допомогою використання комп'ютерного моделювання [Kim et al., 1999] і основані на взаємодії IL-1b і IL-1R типу І [Vigers et al., 1997]. На моделі зв'язування IL-18 з IL-18BP залишок Glu (Е) на позиції 42 і залишок Lys (К) на позиції 89 IL-18, як передбачали, зв'язуються з 5 86750 6 Lys-130 і Glu-114 в IL-18BP, відповідно [Kim et al., вані на мутаціях двох пар нуклеотидів в екзоні 2 1999]. [Kumar, 2002, Pan, 2001]. Незважаючи на вивчення IL-18BP конститутивно присутній в багатьох обширної бази даних і секвенування локусу гена клітинах [Puren et al., 1999] і циркулює у здорових IL-1, мишачий гомолог IL-1 H4 досі не виявлений. людей [Urushihara et al., 2000]. Висока споріднеIL-lF7b має значну гомологічність послідовності з ність IL-18BP з IL-18, а також висока концентрація IL-18. Відмінною ознакою активності IL-18 є його IL-18BP, виявлена в циркуляції (молярне перевиздатність індукувати IFN-g в Т-клітинах або натущення в 20 раз в порівнянні з IL-18), представляральних кіл ерах (NK) в присутності IL-2, IL-12 або ють унікальну ситуацію в біології цитокінів. Таким IL-15 як спільного стимулятора. Активність IL-18 чином, було висловлене припущення, що більопосередковується комплексом IL-18R, що склашість, якщо не всі, молекул IL-18 в циркуляції зв'ядається з IL-18R.cc, який закінчується лігандзв'язані з IL-18BP. Циркулюючий IL-18BP, який конкузувальним ланцюгом [Torigoe, 1997], і IL-18(3, що рує з рецепторами клітинної поверхні для IL-18, закінчується сигнальним ланцюгом (3) [Born, 1998, може діяти як природна протизапальна і імунодепKim, 2001]. Після зв'язування з ланцюгом IL-18Ra і ресантна молекула. утворення гетерокомплексу з ланцюгом IL-18Rb, Вірусні агенти кодують ІL-18ВР-подібні білки, IL-18 індукує активацію кінази, зв'язаної з рецептонаприклад, вірусні білки M.contagiosum MC53 і ром IL-1, і фактора 6, зв'язаного з рецептором TNF МС54 володіють значною гомологічністю з IL-18BP (TRAF-6). Вказані активовані кінази в кінцевому ссавців [Novick et al., 1999]. Білки M.contagiosum результаті приводять до транслокації ядерного MC53 і МС54 мають здатність зв'язувати і нейтрафактора k-В (NF-kB) (Matsumoto, Robinson). ILлізувати людський IL-18, що подібна до вказаної lF7b, як повідомляється, зв'язується з IL-18Ra, за здатності IL-18BP [Xiang і Moss, 1999]. Білок поксрезультатами дослідження рецепторів pulldown вірусу ектромелії р13, який є гомологічним з ILassay [Pan, 2001] або досліджень зв'язування з 18BP, зв'язує людський IL-18 та інгібує його активвикористанням комп'ютерного чіпа (BiaCoreâ) ність in vitro. У мишей, інфікованих делеційним [Mulero, 2000]. Достовірне, але низькоафінне зв'ямутантним вірусом р13, спостерігалися знижені зування Kd=130мМ спостерігалося тільки для зрірівні інфекційності [Born et al., 2000]. Таким чином, лої форми IL-lF7b, без пропептиду, що передбачає ступінь інфекційності, як виявляється, корелює з біологічний зв'язок з процесингом IL-lF7b зі стороприсутністю вірусного IL-18BP. ни ICE [Kumar, 2002]. Незважаючи на зв'язування з Високі рівні циркулюючого IL-18BP можуть буIL-18Ra, не було показано активності, подібної до ти природним захистом проти надмірних ТhlIL-18, або антагоністичної активності як поперевідповідей на інфекцію і розвитку аутоімунних задника, так і зрілого IL-lF7b [Pan, 2001, Kumar, хворювань. 2002]. Цитокіни сімейства IL-1, включаючи IL-8, маБуло висловлене припущення про те, що інють ряд протизапальних і імунорегуляторних влатерлейкін IL-18 бере участь в розвитку патогенностивостей під час первинної і повторної відповіді сті при хронічних запальних захворюваннях, вклюна інфекцію [Dinarello, 1996 і Nakanishi, 2001]. чаючи ендотоксиновий шок, гепатит і аутоімунний Шість нових членів генного сімейства інтерлейкінудіабет [Kahiwamura і Okamura, 1998]. Подальші 1 (IL-1) були відкриті в результаті вивчення бази вказівки на можливу роль IL-18 в розвитку ушкоданих експресованих мічених послідовностей [Barдження печінки були отримані з експериментів, ton, 2000, Busfield, 2000, Debets, 2001, Kumar, опублікованих Tsuij et al. [Tsuij et al., 1999], які по2000, Lin, 2001, Mulero, 1999, Pan, 2001 і Smith, казали підвищений рівень IL-18 при індукованому 2000]. Вказані білки мають загальний bліпополісахаридами гострому ушкодженні печінки порожнистий профіль, що складається з 12 ниток, і у мишей. Однак, механізм багатофункціонального значну амінокислотну гомологічність з антагонісфактора IL-18 при розвитку ушкодження печінки том рецепторів IL-1 (IL-1Ra), IL-1b і IL-18. Вказані досі не освітлений. нові члени сімейства IL-1 отримані від загального Ураження або ушкодження печінки може мати попередника, як і IL-1 і IL-18 [Nicklin, 2002, Taylor, різноманітні причини. Це може відбуватися через 2002]. За винятком IL-18, кожен знаходиться на вірусні або бактеріальні інфекції, зловживання одній і тій самій області людської хромосоми 2 алкоголем, імунні розлади або, наприклад, злоякі[Nicklin, 2002, Mulero, 2000, Taylor, 2002 і Busfield, сні пухлини. 2000]. Біологічна функція даних гомологів IL-1 до Вірусні гепатити, викликані вірусом гепатиту В цього часу невідома. Було описано п'ять різних і вірусом гепатиту С, наприклад, являють собою сплайсованих варіантів нового гомолога IL-1 IL-IH4 захворювання, що погано піддаються лікуванню, (IL-1F7a-e) [Busfield, 2000, Kumar, 2000, Pan, 2001, які уражають велику кількість людей у всьому світі. Smith, 2000, Taylor, 2002]. Перша описана ізофорКількість відомих вірусів гепатиту постійно росте. ма, IL-lF7a, має унікальний N-кінець, що складаКрім вірусів гепатиту В і С, щонайменше чотири ється з екзону 3 гена IL-1 F7, який відсутній в інінших віруси, що викликають вірусний гепатит, ших сплайсованих варіантах гена. Короткі були відкриті до теперішнього часу, названі віруізоформи IL-1F7c, IL-1F7d і IL-1F7e не мають екзосами гепатиту A, D, Е і G. ну 4, 2 або обох, відповідно. Тільки IL-lF7b і с, що Алкогольне захворювання печінки являє сомістять екзон 1 і 2, експресують N-кінцевий продобою інше широко поширене захворювання печінки, мен, який має потенційний сайт (сайги) розщеппов'язане з хронічним вживанням алкоголю. Імунлення каспазою-1 (ICE) [Kumar, 2002]. Крім вказаний гепатит являє собою рідке аутоімунне захвоних сплайсованих варіантів, в IL-lF7b існують рювання, яке погано піддається лікуванню. Ушкоамінокислотні поліморфізми (V31G і А42Т), оснодження печінки включає також ураження жовчних 7 86750 8 були оточені лімфоїдними агрегатами. Дані покапротоків. Первинний біліарний цироз (РВС) являє зують, що клітини Th1 є найбільш поширеною субсобою аутоімунне захворювання печінки, яке харапопуляцією Т-клітин в лімфоїдних інфільтратах ктеризується деструкцією внутрішньопечінкових при РВС [Harada et al., 1997]. Цитокіновий профіль жовчних протоків. для розпізнавання вірусних антигенів, як вважаДекілька досліджень показали, що ушкодженють, має виражений вплив на вихід вірусних інфеня печінки при таких захворюваннях, як алкоголькцій і вірусний кліренс. В одному дослідженні виний гепатит, цироз печінки, вірусний гепатит і первчали, чи відіграє роль дисбаланс цитокінів, винний біліарний цироз, пов'язане з відповідями з орієнтований у бік відповіді типу Th2, при хронічбоку клітин Т-хелперів-1 (Тh1). В одному досліному гепатиті В. Цитокінові профілі мононуклеардженні була розроблена нова модель ушкодження них клітин периферичної крові, пов'язані з хронічпечінки на мишах шляхом націлення ліпосом, що ним гепатитом В, аналізували з допомогою RTмістять овальбумін, в печінку, з подальшим адопPCR. Після стимуляції поверхневим антигеном тивним перенесенням овальбумін-специфічних клітин Тh1. Комбінований вплив на мишей ліпосогепатиту В (HbsAg) експресію IFN-g, IL-2, IL-4 і ILмами, що містять овальбумін, і перенесенням клі10 виявляли у 41%, 8%, 41% і 50% пацієнтів, відтин Тh1 спричиняло підвищення активності сироповідно. Серед вказаних цитокінів експресія Th1 ваткових трансаміназ, яке спостерігалося цитокіну IFN-g була пов'язана з високими рівнями паралельно з підвищенням сироваткових рівнів сироваткових АСТ/АЛТ (аспартатамінотрансфераIFN-g. Різким контрастом було те, що перенесення зи/аланінамінотрансферази), які є типовими маровальбумін-специфічних клітин Th2 приводило до керами ушкодження печінки. Не було виявлено підвищення рівнів IL-4, але не індукувало ушкозахисного ефекту відносно гепатитів, що викликадження печінки. Ушкодження печінки блокувалося ються цитокінами типу Th2. На закінчення, виробантитілами проти IFN-g і антитілами проти фактора лення цитокіну Th1, IFN-g, HbsAg-реактивними клітинами було пов'язане з ушкодженням гепатонекрозу пухлин (TNF)-a. Вказані факти свідчать цитів при хронічному гепатиті В [Lee et al., 1999]. про те, що клітини Тh1 є головними ефекторними Високі рівні ліганду FAS і його рецептора (CD95) клітинами при гострому ушкодженні печінки [Niбули виявлені в печінці пацієнтів з гепатитом В shimura і Ohta, 1999]. В іншій серії досліджень було [Luo et al., 1997]. Ліганд FAS вважають одним з показано, що у мишей з надмірною експресією головних цитотоксичних агентів, який приводить IFN-g спостерігається спонтанний гепатит, при віддо апоптозу гепатоцитів. сутності якого б то не було патогена або будьВ іншому дослідженні ідентифікували фактоякого іншого подразника [Okamoto et al., 1998]. ри, пов'язані з прогресуванням ушкодження печінІнше дослідження включало вивчення відповіки у 30 пацієнтів, позитивних по вірусу гепатиту дей Тh1 при первинному біліарному цирозі (РВС). С/РНК (HCV/RNA), з хронічним гепатитом. НекроРВС являє собою аутоімунне захворювання печінтичне/запальне і структурне ушкодження оцінюваки, що характеризується деструкцією внутрішньоли з використанням шкали Ishak. Активовані печінпечінкових жовчних протоків. Звичайно вважають, кові зірчасті клітини (HSC) візуалізували що клітинні імунні механізми, особливо із залученімуногістохімічним аналізом на гладком'язевий aням Т-клітин, приводять до ушкодження жовчних протоків. Відносна сила відповідей Тh1 і Тh2, як актин (a-SMA) і визначали їх кількість морфометприпустили нещодавно, є важливим чинником парично. HCV/RNA в плазмі крові оцінювали з викотофізіології різних аутоімунних захворювань. У ристанням методики конкурентної RT-PCR. Для даному дослідженні баланс субпопуляцій при РВС того, щоб вивчити тип імунної відповіді, що бере оцінювали шляхом виявлення цитокінів, специфічучасть в прогресуванні ушкодження печінки, IFN-gних для двох субпопуляцій Т-клітин, тобто, IFN-g позитивні клітини (як експресія Тh1-подібної відподля клітин Th1 і IL-4 для клітин Th2. Клітини, позивіді) оцінювали з використанням імуногістохімічного аналізу визначали їх кількість морфометрично. тивні за матричною РНК (мРНК) IFN-g і IL-4, підраБуло встановлено, що HSC виявляли, головним ховували в зрізах печінки від 18 пацієнтів з РВС і чином, поблизу від областей лобулярного некро35 контролів захворювання, включаючи хронічний зу/запалення або від вистілки фіброзних перегоактивний гепатит С, позапечінкову біліарну обструкцію і нормальну печінку, з використанням родок. Паренхіма, позитивна по a-SMA і сіріусу неізотопної гібридизації і імуногістохімічного аналічервоному, корелювала достовірно з сумою балів зу in situ. Мононуклеарні клітини, що експресують по некрозу/запаленню і структурному ушкодженню. мРНК IFN-g і IL-4, були агреговані в запалених IFN-g-позитивні клітини виявляли в перипортальпортальних шляхах печінки з РВС, але рідко були них областях, пов'язаних з запальними інфільтраприсутніми в зрізах печінки при позапечінковій тами, і вони достовірно корелювали зі структурним біліарній обструкції, алкогольному фіброзі або ноушкодженням. Таким чином, був зроблений висновок про те, що активація HSC і прогресування рмальній печінці. Клітини, позитивні за мРНК IFN-g ушкодження печінки пов'язані з Th1-подібною віді IL-4, в печінці з РВС виявляли в достовірно більш повіддю [Ваrоnі et аl., 1999]. Подібно до випадку з високих кількостях, ніж в контрольній печінці гепатитом В, FAS ліганд і його рецептор були ви(Р