Спосіб визначення зиготності bm3 мутантного алеля і алеля comt дикого типу з використанням тканини рослини кукурудзи

Реферат: Даний винахід пропонує удосконалення процесу селекції кукурудзи, зокрема стосується способу визначення зиготності алеля мутанта bm3 та алеля COMT дикого типу з використанням тканин рослини кукурудзи. Також запропоновано спосіб надійної і передбачуваної інтрогресії UA 113613 C2 (12) UA 113613 C2 ознаки низького вмісту лігніну в зародкову плазму рослини. Винахід дозволяє ефективно визначати зиготність алеля мутанта bm3 та алеля COMT дикого типу. UA 113613 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дана заявка заявляє пріоритет по даті подачі попередньої заявки на видачу патенту США з реєстраційним номером 61/334073, поданої 12 травня 2010, "Use of brown midrib-3 gene specific markers in maize for trait introgression". ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ, ДО ЯКОЇ НАЛЕЖИТЬ ВИНАХІД Даний опис, загалом, стосується селекції рослин. Пропонуються способи визначення зиготності рослин, що містять мутації коричневої середньої жилки (brown midrib 3, bm3). Способи, розкриті в описі, крім того, застосовні для удосконалення способу селекції BMRвмісних ліній рослин. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ Лігніни є універсальними компонентами в рослинах, які поперечно зв'язуються з вуглеводами, такими як геміцелюлози, в клітинній стінці. Полімери лігніну знижують розщеплення волокон у жуйних, і ступінь лігніфікації може бути зворотно пропорційним перетравлюваності кормових культур. Cherney et al. (1991) Adv. Agron. 46:157-98. Кукурудза, що містить мутацію коричневої середньої жилки brown midrib (BMR) має червонувато-коричневу пігментацію середньої жилки листа, що асоційовано зі значно зниженим вмістом лігніну, зміненим складом лігніну і поліпшеною перетравлюваністю. Було ідентифіковано щонайменше чотири незалежних мутації BMR у кукурудзи. Kuc et al. (1968) Phytochemistry 7:1435-6. У випадку всіх таких мутацій, названих "bm1, bm2, bm3 і bm4", є знижений вміст лігніну в порівнянні з контрольною кукурудзою. Мутації bm3 включають інсерції (bm3-1), делеції (bm3-2) та інсерції/делеції (bm3-3) в гені О-метилтрансферази кофеїнової кислоти (COMT, наприклад, GenBank Accession No. M73235). Morrow et al. (1997) Mol. Breeding 3:351-7; Vignols et al. (1995) Plant Cell 7:407-16. Ген COMT контролює ферментативні активності, залучені до біосинтезу лігніну. COMT використовує S-аденозилметіонін для трансметилювання кофеїнової кислоти, що приводить до утворення ферулової кислоти. У кінцевому результаті з ферулової кислоти утворюються коніфериловий спирт і синапіловий спирт. Поєднання коніферилового, ферулового і синапілового спиртів в присутності вільних радикалів приводить до продукції лігніну. Мутації Bm3 були охарактеризовані, і вважається, що вони інгібують трансметилювання кофеїнової кислоти внаслідок інактивації генів. Guillet-Claude et al. (2004) Theor. Appl. Genet. 110: 126-35; Piquemal et al. (2002) Plant Physiology 130: 1-11; He et al. (2003) Crop Sci. 43: 2240-51; Morrow et al. (1997) Mol. Breeding 3: 351-7; Vignols et al. (1995) Plant Cell 7: 407-16. Однак не розроблено швидкого способу для специфічного виявлення і тестування зиготності конкретної рослини по локусу bm3. СУТЬ ВИНАХОДУ У даному описі розкриті способи високопродуктивної основаної на ПЛР молекулярної характеристики сортів кукурудзи BMR (наприклад, мутантів bm3), які можуть значно поліпшити процес селекції BMR-вмісних ліній. Розкриті способи визначення зиготності зразка рослинної тканини, і отже рослини, з якої одержаний зразок, за допомогою визначення присутності або відсутності алелей мутанта bm3 і COMT дикого типу. Таким чином, пропонується аналіз зиготності на основі ПЛР з реєстрацією в кінцевій точці з використанням зондів, які працюють за принципом гідролізу (який в даному описі вказаний як аналіз TaqMan®), який специфічно виявляє і тестує стан зиготності в локусі bm3. Розкриті аналізи, в яких використовують біплекси олігонуклеотидів, специфічних до мутанта bm3 і до відповідних послідовностей дикого типу, в одному і тому ж аналізі. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1 включає схематичне представлення гена COMT з мутаціями bm3 і олігонуклеотиди, сконструйовані для часткової ампліфікації гена COMT (~1,8 т. п. н.). На фіг. 2 зображена ампліфікація неповної послідовності гена COMT з дванадцяти ліній bm3 і трьох ліній не-bm3 (ліній дикого типу). ПЛР-продукти візуалізували в 2 % E-Gel® і потім екстрагували, використовуючи 0,8 % E-Gel®, для подальшого клонування у векторі pCR4TOPO®. На фіг. 3 показане вирівнювання консенсусних послідовностей мутантів bm3 і генів COMT дикого типу. Три раніше описаних делеційних/інсерційних мутацій підкреслені. На фіг. 4 включає схематичне представлення гена COMT з праймерами, специфічними до мутації bm3 та інтактного гена COMT. (А) Ген COMT з пунктирними лініями означає делецію bm3. Специфічні для гена COMT праймери знаходяться в межах сайту делеції. (В) Мутантний ген bm3. Специфічні для bm3 олігонуклеотиди знаходяться в місці з'єднання, де прямий і зворотні олігонуклеотиди, які фланкують сайт делеції, і зонд охоплюють делетовану область. Фіг. 5a і 5b містять графіки ПЛР-ампліфікації в реальному часі, де показані відносні одиниці флуоресценції (RFU) для bm3 (a) з використанням FAM і (b) для COMT дикого типу з 1 UA 113613 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використанням VIC (замінювали Hex через обмеження приладу для ПЛР в реальному часі). Експонентну фазу ампліфікації спостерігали з 22 по 36 цикл як у випадку гена bm3, так і у випадку гена COMT дикого типу. На фіг. 6 показані визначення генотипів, здійснювані з використанням аналізу, що розрізняє алелі на основі вимірювання у відносних одиницях флуоресценції FAM для алеля 1 (гомозиготний bm3) і VIC (Hex, що замінюється через обмеження приладу) у випадку алеля 2 (гомозиготний COMT дикого типу) в циклі 30. На фіг. 7 показані визначення зиготності bm3, здійснювані з використанням аналізу TaqMan® з реєстрацією в кінцевій точці. Після завершення ПЛР і реєстрації флуоресценції одержували графік розподілу як описано нижче: SOB1 = сигнал вище фону FAM (сигнал зразка вище середнього фонового сигналу при 535 нм), SOB2 = сигнал вище фону VIC (сигнал зразка вище середнього фонового сигналу при 560 нм). Визначення генотипу здійснювали, використовуючи SOB1/SOB2