Доставка терапевтичних агентів до цнс
Номер патенту: 115648
Опубліковано: 11.12.2017
Автори: Пен Джінг, МакКолі Томас, Шарок Зара, Поуелл Джан, Райт Тереза Ліа, Чарнас Лоренс, Пфейфер Річард, Каліас Перікл
Формула / Реферат
1. Фармацевтична композиція, яка містить фермент, що є замісним для лізосомального ферменту, причому замісний фермент представлений у композиції у концентрації 10-150 мг/мл, та композиція містить до 10 мМ фосфату, NaCl та полісорбат і при цьому має рН від 5,5 до 7,0.
2. Фармацевтична композиція за п. 1, де NaCl присутній у концентрації до 300 мМ.
3. Фармацевтична композиція за п. 1 або 2, де полісорбат являє собою полісорбат 20.
4. Фармацевтична композиція за п. 3, де полісорбат 20 присутній у концентрації 0,001-0,5 %.
5. Фармацевтична композиція за п. 0, де фермент присутній у концентрації принаймні 30 мг/мл.
6. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 0-5, де композиція має рН, що становить приблизно 6,0.
7. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 0-6, яка додатково містить один або більше з (i) буферного агента, (ii) поверхнево-активної речовини або (iii) регулятора тонічності.
8. Фармацевтична композиція за п. 7, яка містить поверхнево-активну речовину.
9. Фармацевтична композиція за п. 8, де поверхнево-активна речовина присутня у концентрації приблизно 0,001-0,5 %.
10. Фармацевтична композиція за п. 7, яка містить поверхнево-активну речовину та регулятор тонічності.
11. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 8-10, де поверхнево-активна речовина містить полісорбат або полоксамер.
12. Фармацевтична композиція за п. 11, де полісорбат або полоксамер присутній у концентрації 0,005-0,2 %.
13. Фармацевтична композиція за п. 11, де полісорбат або полоксамер присутній у концентрації 0,005-0,02 %.
14. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 0-13, яка рецептована у вигляді однієї дози, що має об’єм, менший за 5 мл або менший за 3 мл.
15. Фармацевтична композиція за будь-яким з пп. 0-14, у якій замісний фермент:
(і) містить залишки маноза-6-фосфату (М6Р); та/або
(іі) являє собою гібридний білок, який містить групу, яка забезпечує спрямовану доставку до лізосом.
16. Спосіб лікування лізосомної хвороби накопичення, асоційованої зі зниженням рівня або активності лізосомального ферменту, де лікування передбачає наступні стадії:
інтратекальне введення суб'єкту, що страждає на або має схильність до лізосомної хвороби накопичення, композиції, яка містить замісний фермент для лізосомального ферменту, причому замісний фермент представлений у композиції у концентрації 10-150 мг/мл та композиція містить до 10 мМ фосфату, NaCl та полісорбат і при цьому композиція має рН від 5,5 до 7,0.
17. Спосіб за п. 16, де композиція додатково містить один або більше з (i) буферного агента, (ii) поверхнево-активної речовини або (iii) регулятора тонічності.
18. Спосіб за п. 17, де композиція містить поверхнево-активну речовину.
19. Спосіб за п. 18, де поверхнево-активна речовина присутня у концентрації приблизно 0,001-0,5 %.
20. Спосіб за будь-яким з пп. 16-19, де композиція має рН, що становить приблизно 6,0.
21. Спосіб за будь-яким з пп. 16-20, у якому композицію вводять у об'ємі однієї дози, меншому ніж 5 мл, або у об'ємі однієї дози, меншому ніж 3 мл.
22. Спосіб за будь-яким з пп. 16-21, у якому зазначене інтратекальне введення композиції не викликає суттєвих побічних ефектів у суб'єкта.
23. Спосіб за будь-яким з пп. 16-22, у якому зазначене інтратекальне введення здійснюють за відсутності супутньої імунопригнічуючої терапії.
24. Спосіб за будь-яким з пп. 16-23, у якому зазначений спосіб не включає попереднього лікування або попередньої підготовки суб'єкта із застосуванням агентів для імуносупресії Т-клітин.
25. Спосіб за будь-яким з пп. 16-24, у якому зазначене інтратекальне введення композиції забезпечує досягнення принаймні 10 % нормального рівня або активності лізосомального ферменту в одній або більше тканинах головного мозку, спинного мозку й периферичних органів.
26. Спосіб за п. 25, у якому одна або більше тканин головного мозку включають тканину оболонки.
27. Спосіб за п. 25 або п. 26, у якому одна або більше тканин головного мозку включають тканини великого мозку.
28. Спосіб за п. 27, у якому тканини великого мозку являють собою глибокі тканини великого мозку.
29. Спосіб за будь-яким з пп. 25-28, у якому одна або більше тканин головного мозку включають тканину мозочка.
30. Спосіб за п. 29, у якому тканина мозочка являє собою глибоку тканину мозочка.
31. Спосіб за будь-яким з пп. 25-30, у якому одна або більше тканин головного мозку включають тканини стовбура головного мозку.
32. Спосіб за п. 25, у якому тканини включають глибокі тканини.
33. Спосіб за будь-яким з пп. 16-32, у якому доза, яку вводять суб’єкту:
(і) знаходиться в діапазоні від 0,005 мг/кг ваги мозку до 100 мг/кг ваги мозку;
(іі) є більшою за 1 мг/кг ваги мозку;
(ііі) є більшою за 10 мг/кг ваги мозку; або
(іv) є більшою за 30 мг/кг ваги мозку.
34. Спосіб за будь-яким з пп. 16-33, у якому періодичність введення становить один раз на два тижні, один раз на місяць або один раз на два місяці.
35. Спосіб за будь-яким з пп. 16-34, у якому лізосомна хвороба накопичення вибрана з групи, яка включає аспартилглюкозамінурію, хворобу накопичення ефірів холестерину, хворобу Вольмана, цистиноз, хворобу Данона, хворобу Фабрі, ліпогранулематоз Фарбера, хворобу Фарбера, фукозидоз, галактосіалідоз I/II типу, хворобу Гоше I/II/III типів, лейкодистрофію глобоїдних клітин, хворобу Краббе, хворобу накопичення глікогену II типу, хворобу Помпі, GM1-гангліозидоз I/II/III типів, GM2-гангліозидоз I типу, хворобу Tея-Сакса, гангліозидоз GM2 типу ІІ, хворобу Сандхофа, GM2-гангліозидоз, α-манозидоз I/II типів, β-манозидоз, метахроматичну лейкодистрофію, муколіпідоз I типу, сіалідоз I/II типів, муколіпідоз II/III типів, I-клітинну анемію, муколіпідоз IIIC типу, псевдополідистрофію Хурлера, мукополісахаридоз I типу, мукополісахаридоз II типу, синдром Хантера, мукополісахаридоз IIIA типу, синдром Санфіліппо типів А, В або С, мукополісахаридоз IIIB типу, мукополісахаридоз IIIC типу, мукополісахаридоз IIID типу, мукополісахаридоз IVA типу, синдром Моркіо, мукополісахаридоз IVB типу, мукополісахаридоз VI типу, мукополісахаридоз VII типу, синдром Слая, мукополісахаридоз IX типу, множинний дефіцит сульфатази, нейронний цероїдний ліпофусциноз, CLN1 хворобу Баттена, CLN2 хворобу Баттена, хворобу Німана-Піка А/В типів, хворобу Німана-Піка С1 типу, хворобу Німана-Піка С2 типу, пікнодизостоз, хворобу Шиндлера I/II типів, хворобу Гоше і хворобу накопичення сіалових кислот.
36. Спосіб за будь-яким з пп. 16-35, у якому лізосомна хвороба накопичення вибрана з групи, яка включає синдром Хантера, метахроматичну лейкодистрофію (МЛД), синдром Санфіліппо типу А, синдром Санфіліппо типу В і лейкодистрофію глобоїдних клітин (ЛГК).
37. Спосіб за п. 36, у якому замісний фермент вибраний із групи, яка включає рекомбінантні ідуронат-2-сульфатазу (I2S), арилсульфатазу А (ASA), гепаран-N-сульфатазу (HNS), альфа-N-ацетилглюкозамінідазу (Naglu) і β-галактозидазу (GLC).
38. Спосіб за будь-яким з пп. 16-37, у якому замісний фермент містить залишки маноза-6-фосфату (М6Р).
39. Спосіб за будь-яким з пп. 16-38, у якому замісний фермент являє собою гібридний білок, який містить групу, яка забезпечує спрямовану доставку до лізосом.
40. Спосіб за будь-яким з пп. 16-39, у якому інтратекальне введення додатково забезпечує системну доставку замісного ферменту до периферичних тканин-мішеней.
41. Спосіб за п. 40, у якому периферичні тканини-мішені вибрані з печінки, нирок, селезінки і/або серця.
42. Спосіб за будь-яким з пп. 16-41, у якому інтратекальне введення приводить до лізосомальної локалізації замісного ферменту в тканинах-мішенях головного мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях.
43. Спосіб за будь-яким з пп. 16-42, у якому інтратекальне введення приводить до зменшення накопичення ГАГ у тканинах-мішенях головного мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях.
44. Спосіб за п. 43, у якому накопичення ГАГ знижується щонайменше на 20 %, 40 %, 50 %, 60 %, 80 %, 90 %, у 1 раз, у 1,5 рази або в 2 рази в порівнянні з контролем.
45. Спосіб за будь-яким з пп. 16-44, у якому інтратекальне введення приводить до збільшення ферментативної активності замісного ферменту в тканинах-мішенях мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях.
46. Спосіб за п. 45, у якому ферментативна активність збільшується щонайменше в 1 раз, у 2 рази, в 3 рази, в 4 рази, в 5 разів, у 6 разів, у 7 разів, у 8 разів, у 9 разів або в 10 разів у порівнянні з контролем.
47. Спосіб за п. 45 або 46, у якому ферментативна активність збільшується в поперековій області.
48. Спосіб за будь-яким з пп. 16-47, у якому лізосомна хвороба накопичення асоційована з периферичними симптомами, і спосіб додатково включає внутрішньовенне введення суб'єктові замісного ферменту.
49. Спосіб за п. 48, у якому внутрішньовенне введення здійснюють не частіше, ніж один раз на місяць.
50. Спосіб за будь-яким з пп. 16-47, у якому лізосомна хвороба накопичення асоційована з периферичними симптомами, і спосіб не включає введення суб'єктові внутрішньовенно замісного ферменту.
Текст
Реферат: Даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить фермент, що є замісним для лізосомального ферменту, причому замісний фермент представлений у композиції у концентрації 10-150 мг/мл, та композиція містить до 10 мМ фосфату, NaCl та полісорбат і при цьому має рН від 5,5 до 7,0. UA 115648 C2 (12) UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Перехресні посилання на родинні заявки [0001] Дана заявка претендує на пріоритет за попередніми заявками на патент США під номерами 61/358,857 з датою подачі 25 червня 2010 р.; 61/360,786 з датою подачі 1 липня 2010 р.; 61/387,862 з датою подачі 29 вересня 2010 р.; 61/435,710 з датою подачі 24 січня 2011 р.; 61/442,115 з датою подачі 11 лютого 2011 р.; 61/476,210 з датою подачі 15 квітня 2011р.; і 61/495,268 з датою подачі 9 червня 2011 р.; кожна з яких включена до даної заявки за допомогою посилання. Родинними для даної заявки є заявки на патент США під заголовком "Способи та композиції для доставки до ЦНС гепаран-N-сульфатази" з такою ж датою подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС ідуронат-2-сульфатази", та ж дата подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС β-галактоцереброзидази", та ж дата подачі; "Способи та композиції для доставки до ЦНС арилсульфатази A", та ж дата подачі; "Лікування синдрому Санфіліппо типу B", та ж дата подачі; кожна з яких включена до даної заявки за допомогою посилання. Передумови створення винаходу [0002] Замісна ферментна терапія (ЗФТ) включає системне введення суб'єктам природних або рекомбінантних білків і/або ферментів. Схвалені терапевтичні засоби зазвичай вводять суб'єктам внутрішньовенно і зазвичай вони є ефективними при лікуванні соматичних симптомів первинної ферментної недостатності. У результаті обмеженого розподілу введеного внутрішньовенно білка і/або ферменту по клітинах і тканинах центральної нервової системи (ЦНС) лікування захворювань, що мають етіологію, пов'язану з ЦНС, є особливо складним завданням, оскільки введені внутрішньовенно білки і/або ферменти не проникають у достатній мірі через гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ). [0003] Гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) − це структурна система, яка складається з ендотеліальних клітин, функцією яких є захист центральної нервової системи (ЦНС) від шкідливих речовин у крові, таких як бактерії, макромолекули (наприклад, білки) та інші гідрофільні молекули, шляхом обмеження проникнення подібних речовин через ГЕБ до спинномозкової рідини (СМР) і ЦНС. [0004] Існує декілька способів обійти ГЕБ для покращення доставки терапевтичного агента до мозку, в тому числі пряма внутрішньочерепна ін'єкція, короткочасна пермеабілізація ГЕБ і модифікація активного агента, яка змінює розподіл у тканинах. Пряма ін'єкція терапевтичного агента до тканин мозку повністю обходить судинну систему, але пов'язана в першу чергу з ризиком ускладнень (інфекція, ушкодження тканин, імунна відповідь), які виникають у результаті внутрішньочерепних ін'єкцій і слабкої дифузії активного агента з місця введення. На даний момент пряме введення білків до мозкової речовини не забезпечило значного терапевтичного ефекту внаслідок існування бар'єра для дифузії та обмеженого об'єму складу, який може бути введений. Була вивчена дифузія з конвекцією через катетери, розміщені в паренхімі мозку, з використанням повільної довгострокової інфузії (Bobo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), однак у жодному зі схвалених способів терапії цей підхід не використовується для тривалого лікування. Крім того, розміщення внутрішньомозкових катетерів є вкрай інвазивним і є менш бажаною клінічною альтернативою. [0005] Також були розпочаті спроби здійснити інтратекальну (ІТ) ін'єкцію або введення білків до спинномозкової рідини (СМР), але вони також не призвели до терапевтичного успіху. Однією з основних проблем при такому лікуванні є схильність активної речовини до дуже щільного зв'язування з епендимною вистилкою шлуночка, яке заважає наступній дифузії. У даний час є відсутніми дозволені продукти для лікування генетичного захворювання мозку шляхом прямої доставки агентів до СМР. [0006] Насправді, багато хто вважає, що бар'єр для дифузії на поверхні мозку, а також відсутність ефективних і зручних способів доставки, є занадто суттєвою перешкодою для досягнення відповідного терапевтичного ефекту в головному мозку при лікуванні будь-якого захворювання. [0007] Багато які з лізосомних хвороб накопичення зачіпають нервову систему, що особливо ускладнює лікування цих хвороб за допомогою традиційних методів терапії. Часто зустрічаються значні накопичення глюкозоаміногліканів (ГАГ) у нейронах і в мозкових оболонках хворих індивідів, що призводить до різних форм симптомів з боку ЦНС. На сьогоднішній день не відомі випадки успішного лікування симптомів з боку ЦНС, викликаних лізосомними хворобами, з використанням доступних засобів. [0008] Таким чином, залишається велика потреба в ефективній доставці терапевтичних речовин до мозку. Зокрема, існує велика потреба в більш ефективній доставці активних речовин до центральної нервової системи для лікування лізосомних хвороб накопичення. 1 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Короткий опис винаходу [0009] Даний винахід забезпечує ефективний і менш інвазивний підхід для прямої доставки терапевтичних агентів до центральної нервової системи (ЦНС). Зокрема, даний винахід оснований на несподівано виявленому факті, який полягає в тому, що заміщуючий фермент для лізосомних хвороб накопичення може бути прямо введений до спинномозкової рідини (СМР) суб'єкта, що потребує лікування, у високій концентрації (наприклад, більше 3 мг/мл, 4 мг/мл, 5 мг/мл, 10 мг/мл або більше), завдяки чому фермент ефективно й активно проникає через різні поверхні та поширюється в різних областях мозку, включаючи глибокі області мозку. Зовсім несподівано автори даного винаходу продемонстрували, що доставка такої високої концентрації білка може бути досягнута з використанням простих фізіологічних або буферних розчинів, не викликаючи суттєвих побічних ефектів, таких як різко виражена імунна відповідь, у суб'єкта. Таким чином, даний винахід забезпечує високоефективний, клінічно бажаний і зручний для пацієнта підхід для прямої доставки до ЦНС для лікування різних захворювань і розладів, пов'язаних із компонентами ЦНС, зокрема лізосомних хвороб накопичення. Даний винахід являє собою значне досягнення в області спрямованої доставки речовин до ЦНС і замісної ферментної терапії. [0010] Серед іншого, даний винахід відноситься до способів інтратекального (ІT) введення терапевтичного агента (наприклад, заміщуючого ферменту) суб'єктові, що потребує лікування. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент може бути рекомбінантним, генноактивованим або природним ферментом. У даній заявці терміни "інтратекальне введення", "інтратекальна доставка" або їхні граматичні еквіваленти відносяться до ін'єкції до спинномозкового каналу (інтратекальний простір, який оточує спинний мозок). У деяких варіантах реалізації, "інтратекальне введення" або "інтратекальна доставка" відповідно до даного винаходу відноситься до ІТ введення або доставки через поперековий відділ чи область, тобто до поперекового (люмбального) ІТ введення або доставки. У даній заявці термін "поперековий відділ" або "поперекова область" відноситься до області між третім і четвертим поперековими хребцями (нижня частина спини), включаючи L2-S1 відділи хребта. Припускається, що поперекове ІT введення або доставка відрізняється від доставки через задню мозочково-мозкову цистерну (тобто ін'єкція через навколишній простір і нижче від мозочка через отвір між черепом і верхньою частиною хребта) тим, що при поперековому ІT введенні або доставці відповідно до даного винаходу забезпечується краща й більш ефективна доставка до дистального спинного каналу, в той час як доставка через задню мозочковомозкову цистерну, серед іншого, як правило, не досягає дистального відділу спинномозкового каналу. [0011] У одному аспекті даний винахід відноситься до способів, які включають стадію інтратекального введення композиції, яка містить фермент, що заміщає лізосомальний фермент, у концентрації більше 5 мг/мл (тобто більше 6 мг/мл, 7 мг/мл, 8 мг/мл, 9 мг/мл, 10 мг/мл, 15 мг/мл, 20 мг/мл, 25 мг/мл, 30 мг/мл, 40 мг/мл, 50 мг/мл, 75 мг/мл або 100 мг/мл) суб'єктові, який страждає на або має схильність до лізосомної хвороби накопичення, пов'язаної зі зменшенням рівня або активності лізосомального ферменту. [0012] У деяких варіантах реалізації, композиція додатково містить один або більше з наступних компонентів: (i) буферний агент, (ii) поверхнево-активну речовину або (iii) регулятор тонічності. У деяких варіантах реалізації, композиція має pH приблизно 3,0-8,0 (тобто 4,0-7,5; 5,0-7,5; 5,5-7,7; 5,5-7,0; 6,0-7,0; 6,5-7,5; 6,5-7,0 або 5,5-6,5). У деяких варіантах реалізації композиція включає заміщуючий фермент у вигляді лікарської речовини, яка не є синтетичною СМР. [0013] У деяких варіантах реалізації композицію вводять у вигляді однієї дози об'ємом менше приблизно 15 мл (наприклад, менше, ніж 10 мл, 9 мл, 8 мл, 7 мл, 6 мл, 5 мл, 4 мл, 3 мл, 2 мл, 1,5 мл, 1,0 мл або 0,5 мл). [0014] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення композиції не призводить до суттєвого негативного ефекту у суб'єкта. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення композиції не призводить до адаптивної Т-клітинно-опосередкованої імунної відповіді. [0015] У іншому аспекті даний винахід відноситься до способів, які включають стадію введення композиції, яка містить фермент, що заміщає лізосомальний фермент, суб'єктові, що страждає на або має схильність до лізосомної хвороби накопичення, пов'язаної зі зменшенням рівня або активності лізосомального ферменту, причому введення включає інтратекальне введення композиції при відсутності супутньої імунопригнічуючої терапії. У деяких варіантах реалізації, спосіб не включає індукції імунної толерантності у суб'єкта, якого лікують. У деяких варіантах реалізації, спосіб не включає попереднього лікування або попередньої підготовки суб'єкта шляхом застосування для імуносупресії Т-клітин. 2 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0016] У іншому аспекті даний винахід відноситься до способів, які включають стадію інтратекального введення суб'єктові, що страждає на або має схильність до лізосомної хвороби накопичення, пов'язаної зі зменшенням рівня або активності лізосомального ферменту, композиції, яка містить фермент, що заміщає лізосомальний фермент, у такій терапевтично ефективній дозі та з таким інтервалом введення, які забезпечують досягнення щонайменше приблизно 10 % (наприклад, щонайменше приблизно 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % або 95 %) нормальних рівнів або активності лізосомальних ферментів у одній або більше тканинах мозку, спинного мозку й периферичних органах. [0017] У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин мозку, до яких доставляється фермент, містить менінгеальну тканину. У деяких варіантах реалізації, менінгеальна тканина обрана з групи, яка включає м'яку мозкову оболонку, тверду мозкову оболонку й павутинну тканину. [0018] У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин мозку, до яких доставляють фермент, включають тканину головного мозку. У деяких варіантах реалізації, тканини головного мозку являють собою поверхневі або неглибокі тканини головного мозку. У деяких варіантах реалізації, поверхневі тканини головного мозку обрані з групи, яка включає тканини м'якої мозкової оболонки, тканини кори головного мозку, гіпокампу, тканини в межах 4 мм від поверхні головного мозку, простору Вірхова-Робіна (ВР), кровоносних судин простору ВР, гіпокампу, частин гіпоталамуса на нижній поверхні головного мозку, зорових нервів і трактів, нюхової цибулини і проекцій, і їх комбінацій. [0019] У деяких варіантах реалізації, тканини головного мозку, до яких доставляють фермент, являють собою глибокі тканини головного мозку. У деяких варіантах реалізації, глибокі тканини головного мозку обрані з групи, яка включає тканини, розташовані глибше кори головного мозку, тканини, розташовані глибше 4 мм від поверхні кори головного мозку, тканини, що лежать глибше 6 мм від поверхні кори головного мозку, тканини, що лежать глибше 10 мм від поверхні кори головного мозку, проміжного мозку, гіпоталамуса, таламуса, вентрального таламуса (субталамуса), заднього мозку, ніжок мозку, червоного ядра, ядра III черепних нервів, глибокої сірої речовини, сочевицеподібних ядер, базальних гангліїв, хвостатого ядра, шкарлупу, мигдалеподібне тіло, бліду кулю і їх комбінації. [0020] У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин мозку, до яких доставляють фермент, включає тканини мозочка. У деяких варіантах реалізації, тканини мозочка обрані з групи, яка включає тканини молекулярного шару, тканини шару клітин Пуркіньє, тканини зернистого шару, мозочкових ніжок і їх комбінацій. У деяких варіантах, тканини мозочка являють собою глибокі тканини мозочка, обрані з групи, яка включає тканини шару клітин Пуркіньє, тканини зернистого шару, глибокі тканини білої речовини мозочка і тканини глибоких ядер мозочка. [0021] У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин мозку, до яких доставляють фермент, включає тканини стовбура мозку. У деяких варіантах реалізації, тканини стовбура мозку обрані з групи, яка включає тканини білої речовини стовбура головного мозку і/або тканини ядер стовбура мозку. [0022] У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин спинного мозку, до яких доставляють фермент, являє собою поверхневі або неглибокі тканини спинного мозку. У деяких варіантах реалізації, поверхневі або неглибокі тканини спинного мозку обрані з групи, яка включає м'яку оболонку, шляхи білої речовини і тканини в межах 4 мм від поверхні спинного мозку. У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин спинного мозку являють собою глибоку тканину спинного мозку. У деяких варіантах реалізації, глибокі тканини спинного мозку обрані з групи, яка включає сіру речовину спинного мозку, клітини епендими і тканини, розташовані глибше 4 мм від поверхні спинного мозку. [0023] У деяких варіантах реалізації, одна або більше тканин мозку, до яких доставляють фермент, включає поверхневі або неглибокі тканини. У деяких варіантах, поверхневі або неглибокі тканини обрані з групи, яка включає м'яку оболонку, тверду оболонку й павутинну тканину мозкової оболонки, тканини м'якої мозкової оболонки, тканини кори головного мозку, тканини в межах 4 мм від поверхні головного мозку, а також їх комбінації. [0024] У деяких варіантах реалізації, тканини, до яких доставляють фермент, включають глибокі тканини. У деяких варіантах реалізації, глибокі тканини мозку обрані з глибокої білої речовини головного мозку, глибокої сірої речовини спинного мозку, мозолистого тіла, перивентрикулярної тканини, таламуса, базальних гангліїв, проміжного мозку, бахромки, тканин, що лежать глибше кори головного мозку, тканин, що лежать глибше 4 мм від поверхні головного мозку, тканин, що лежать глибше 6 мм від поверхні головного мозку, тканин, що лежать глибше 3 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 10 мм від поверхні головного мозку, шару клітин Пуркіньє, тканин зернистого шару, глибокої тканини білої речовини мозочка й глибоких тканин ядер мозочка, і їх комбінацій. [0025] У деяких варіантах реалізації, терапевтично ефективні дози лежать у діапазоні від 0,005 мг/кг ваги мозку до 100 мг/кг ваги мозку. У деяких варіантах реалізації, терапевтично ефективною дозою є 1 мг/кг ваги мозку (наприклад, більше, ніж 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 або 50 мг/кг ваги мозку). У деяких варіантах реалізації, терапевтично ефективною дозою є доза, більша за 30 мг/кг ваги мозку. [0026] У деяких варіантах реалізації, інтервал введення становить один раз на два тижні. У деяких варіантах реалізації, інтервал введення становить один раз на місяць. У деяких варіантах реалізації, інтервал введення становить один раз на два місяці. У деяких варіантах реалізації, інтервал введення становить два рази на місяць. У деяких варіантах реалізації, інтервал введення становить один раз на тиждень. У деяких варіантах реалізації, інтервал введення становить два або кілька разів на тиждень. У деяких варіантах реалізації, введення є безперервним, наприклад, із використанням тривалої насосної перфузії. [0027] У іншому аспекті даний винахід відноситься до способів, які включають стадію введення суб'єктові, що страждає від або має схильність до лізосомної хвороби накопичення, пов'язаної зі зниженим рівнем або активністю лізосомального ферменту, композиції, яка містить фермент, що заміщує лізосомальний фермент, причому введення включає інтратекальне введення композиції, що забезпечує доставку заміщуючого ферменту до глибоких тканин мозку, які лежать глибше, ніж щонайменше 5 мм від зовнішньої поверхні (наприклад, щонайменше на 6 мм, 7 мм, 8 мм, 9 мм, 10 мм, 11 мм, 12 мм або глибше від зовнішньої поверхні). У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент доставляють до глибоких тканин мозку, які щонайменше на 10 мм нижче від зовнішньої поверхні. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент специфічно доставляють до лізосом клітин у глибоких тканинах мозку. [0028] У деяких варіантах реалізації, глибокі тканини мозку, до яких доставляють фермент, обрані з глибокої білої речовини головного мозку, глибокої сірої речовини спинного мозку, мозолистого тіла, перивентрикулярної тканини, таламуса, бахромки, тканин, що лежать глибше кори головного мозку, тканин, що лежать глибше 4 мм від поверхні головного мозку, тканин, що лежать глибше 6 мм від поверхні головного мозку, тканин, що лежать глибше 10 мм від поверхні головного мозку, шару клітин Пуркіньє, тканин зернистого шару, глибокої тканини білої речовини мозочка і ядер глибокої тканини мозочка, і їх комбінацій. [0029] У іншому аспекті даний винахід відноситься до способів, які включають стадію введення інтратекально суб'єктові, що страждає на або має схильність до лізосомної хвороби накопичення, пов'язаної зі зменшенням рівня або активності лізосомального ферменту, композиції, яка містить фермент, що заміщує лізосомний фермент, який продукується в клітинах людини. [0030] У деяких варіантах реалізації, лізосомна хвороба накопичення обрана з групи, яка складається з аспартилглюкозамінурії, хвороби накопичення холестеринових ефірів, хвороби Вольмана, цистинозу, хвороби Данона, хвороби Фабрі, ліпогрануломатозу, хвороби Фабера, фукозидозу, галактосіалідозу I/II типу, хвороби Гоше I/II/III типів, глобоїдної клітинної лейкодистрофії, хвороби Краббе, хвороби накопичення глікогену II типу, хвороби Помпі, GM1гангліозидозу I/II/III типів, GM2-гангліозидозу I типу, хвороби Tея-Сакса, хвороби Сандхофа, GM2-гангліозидозу, α-манозидозу I/II типів, β-манозидозу, метахроматичної лейкодистрофії, муколіпідозу I типу, сіалідозу I/II типів, муколіпідозу II/III типів, муколіпідозу IV типу, I-клітинної анемії, муколіпідозу IIIC типу, псевдо-Хурлера полідистрофії, мукополісахаридозу I типу, мукополісахаридозу II типу, синдрому Хантера, мукополісахаридозу IIIA типу, синдрому Санфіліппо А типу, В типу або D типу (мукополісахаридозу IIIB типу, мукополісахаридозу IIIC типу, мукополісахаридозу IIID типу), мукополісахаридозу IVA типу, синдрому Моркіо, мукополісахаридозу IVB типу, мукополісахаридозу VI типу, мукополісахаридозу VII типу, синдрому Слая, мукополісахаридозу IX типу, множинного дефіциту сульфатази, нейронного цероїдного ліпофусцинозу, CLN1 хвороби Баттена, CLN2 хвороби Баттена, хвороби Німана-Піка А/В типів, хвороби Німана-Піка С1 типу, хвороби Німана-Піка С2 типу, пікнодизостозу, хвороби Шиндлера I/II типів, хвороби Гоше і хвороби накопичення сіалових кислот. [0031] У деяких варіантах реалізації, лізосомна хвороба накопичення обрана з групи, яка включає синдром Хантера, метахроматичну лейкодистрофію (МЛД), синдром Санфіліппо типу А, синдром Санфіліппо типу В і хворобу глобоїдної клітинної лейкодистрофії (ГЛД). У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент обраний із групи, яка включає рекомбінантну ідуромат-2-сульфатазу (I2S), арилсульфатазу А (АSА), гепаран-N-сульфатазу (HNS), альфа-Nацетилглюкозамінідазу (Naglu) і β-галактозидазу (GLC). У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент містить залишки маноза-6-фосфату. У деяких варіантах реалізації, 4 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 заміщуючий фермент являє собою гібридний білок, який містить частину, яка обумовлює спрямовану доставку до лізосом (лізосомний таргетинг). [0032] У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент доставляють до нейронів, гліальних клітин, периваскулярних клітин і/або менінгеальних клітин. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент доставляють потім до нейронів у спинному мозку. [0033] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення додатково забезпечує системну доставку заміщуючого ферменту до периферичних тканин-мішеней. У деяких варіантах реалізації, периферичні тканини-мішені обрані з печінки, нирок і/або серця, ендотелію, кісткового мозку й клітин, що походять від кісткового мозку, селезінки, легенів, лімфатичних вузлів, кісток і хрящів, яєчників і сім'яників. [0034] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення викликає лізосомну локалізацію заміщуючого ферменту в тканинах-мішенях мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення викликає зниження накопичення ГАГ у тканинах-мішенях мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, накопичення ГАГ знижується щонайменше на 20 %, 40 %, 50 %, 60 %, 80 %, 90 %, в 1 раз, в 1,5 рази або в 2 рази в порівнянні з контролем. [0035] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення викликає зменшення вакуолізації в нейронах. У деяких варіантах реалізації, нейрони містять клітини Пуркіньє. [0036] У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення призводить до підвищення ферментативної активності заміщуючого ферменту в тканинах-мішенях мозку, нейронах спинного мозку і/або периферичних тканинах-мішенях. У деяких варіантах реалізації, ферментативна активність підвищується щонайменше в 1 раз, у 2 рази, в 3 рази, в 4 рази, в 5 разів, у 6 разів, у 7 разів, у 8 разів, у 9 разів або в 10 разів у порівнянні з контролем. У деяких варіантах реалізації, підвищена ферментативна активність становить щонайменше приблизно 10 нмоль/год./мг, 20 нмоль/год./мг, 40 нмоль/год./мг, 50 нмоль/год./мг, 60 нмоль/год./мг, 70 нмоль/год./мг, 80 нмоль/год./мг, 90 нмоль/год./мг, 100 нмоль/год./мг, 150 нмоль/год./мг, 200 нмоль/год./мг, 250 нмоль/год./мг, 300 нмоль/год./мг, 350 нмоль/год./мг, 400 нмоль/год./мг, 450 нмоль/год./мг, 500 нмоль/год./мг, 550 нмоль/год./мг або 600 нмоль/год./мг. [0037] У деяких варіантах реалізації, ферментативна активність підвищується в поперековому відділі. У деяких варіантах реалізації, підвищена ферментативна активність у поперековому відділі становить щонайменше приблизно 500 нмоль/год./мг, 600 нмоль/год./мг, 700 нмоль/год./мг, 800 нмоль/год./мг, 900 нмоль/год./мг, 1000 нмоль/год./мг, 1500 нмоль/год./мг, 2000 нмоль/год./мг, 3000 нмоль/год./мг, 4000 нмоль/год./мг, 5000 нмоль/год./мг, 6000 нмоль/год./мг, 7000 нмоль/год./мг, 8000 нмоль/год./мг, 9000 нмоль/год./мг або 10000 нмоль/год./мг. [0038] У деяких варіантах реалізації, лізосомні хвороби накопичення асоційовані з периферичними симптомами, і зазначений спосіб також включає внутрішньовенне введення заміщуючого ферменту суб'єктові. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення здійснюють не частіше, ніж щотижня (наприклад, не частіше, ніж один раз на два тижні, один раз на місяць, один раз на два місяці, один раз на три місяці, один раз на чотири місяці, один раз на п'ять місяців або один раз на шість місяців). У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення являє собою введення частіше, ніж один раз на місяць, наприклад, два рази на тиждень, щотижня або два рази на місяць. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне й інтратекальне введення здійснюють у той самий день. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне й інтратекальне введення не здійснюють протягом деякого періоду часу між введеннями, наприклад, у межах щонайменше 2 днів, у межах щонайменше 3 днів, у межах щонайменше 4 днів, у межах щонайменше 5 днів, у межах щонайменше 6 днів, у межах щонайменше 7 днів або в межах щонайменше одного тижня. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне й інтратекальне введення здійснюють за графіком, наприклад, змінне введення щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення заміняють інтратекальним введенням у графіку введень, наприклад, при графіку внутрішньовенного введення щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісячного введення, кожне третє або четверте, або п'яте внутрішньовенне введення в цьому графіку може бути замінене на інтратекальне введення замість внутрішньовенного. У деяких варіантах реалізації, внутрішньовенне введення заміняє інтратекальне введення в графіку введень, наприклад, у графіку інтратекального щотижневого введення, введення один раз на два тижні, введення два рази на місяць або щомісячного введення, кожне третє або четверте, або п'яте введення в цьому графіку може бути замінене на внутрішньовенне введення замість інтратекального введення. У деяких варіантах реалізації, 5 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 внутрішньовенне й інтратекальне введення здійснюють послідовно, наприклад, спершу здійснюють внутрішньовенне введення (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісячне, дозування протягом двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року і більше) з наступним інтратекальним введенням (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця, дозування протягом більше двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року чи більше). У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення здійснюють першим (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць, щомісяця, один раз на два місяці, один раз на три місяці, дозування протягом двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року, або більше) з наступним внутрішньовенним введенням (наприклад, щотижня, один раз на два тижні, два рази на місяць або щомісяця, дозування протягом більше, ніж двох тижнів, місяця, двох місяців, трьох місяців, чотирьох місяців, п'яти місяців, шести місяців або року, або більше). [0039] У деяких варіантах реалізації, лізосомні хвороби накопичення пов'язані з периферичними симптомами, і спосіб включає введення заміщуючого ферменту інтратекально, але не включає введення заміщуючого ферменту суб'єктові внутрішньовенно. У деяких варіантах реалізації, інтратекальне введення заміщуючого ферменту полегшує чи послаблює один або більше периферичних симптомів ферментної недостатності у суб'єкта. [0040] У іншому аспекті даний винахід відноситься до способів лікування синдрому Хантера, які включають стадію внутрішньовенного введення суб'єкту, що потребує лікування, рекомбінантної ідуромат-2-сульфатази (I2S) у такій терапевтично ефективній дозі та з таким інтервалом введення, при яких знижується інтенсивність, тяжкість чи частота або вповільнюється прояв щонайменше одного симптому чи ознаки синдрому Хантера. У деяких варіантах реалізації, щонайменше один симптом чи ознака синдромуХантера являє собою когнітивний розлад (розлад пізнавальної функції); пошкодження білої речовини; розширення периваскулярного простору в паренхімі головного мозку, гангліїв, мозолистого тіла і/або стовбура мозку; атрофію; і/або вентрикуломегалію. [0041] У ще одному аспекті даний винахід відноситься до способів лікування метахроматичної лейкодистрофії (МЛД), які включають стадію інтратекального введення суб'єкту, що потребує лікування, рекомбінантної арилсульфатази А (arylsulfatase A, ASA) в такій терапевтично ефективній дозі та з такою періодичністю введення, при яких знижується інтенсивність, тяжкість чи частота або вповільнюється прояв щонайменше одного симптому або ознаки МЛД. У деяких варіантах реалізації, щонайменше один симптом або ознака МЛД являє собою підвищений внутрішньочерепний тиск, гідроцефалію внаслідок атрофії речовини головного мозку, накопичення сульфатованих гліколіпідів у мієлінових оболонках центральної й периферичної нервових систем і у внутрішніх органах, прогресивну демієлінізацію, втрату аксонів у ЦНС і ПНС і/або моторну й пізнавальну дисфункцію. [0042] У іншому аспекті даний винахід відноситься до способів лікування синдрому Санфіліппо типу А (Санфіліппо А), які включають стадію інтратекального введення суб'єкту, що потребує лікування, рекомбінантної гепаран-N-сульфатази (heparan-N-sulfatase, HNS) у такій терапевтично ефективній дозі та з такою періодичністю введення, при яких знижується інтенсивність, тяжкість чи частота або вповільнюється прояв щонайменше одного симптому або ознаки синдрому Санфіліппо типу А. [0043] У іншому аспекті даний винахід відноситься до способів лікування синдрому Санфіліппо типу В (Санфіліппо В), які включають стадію інтратекального введення суб'єкту, що потребує лікування, рекомбінантної альфа-N-ацетилглюкозамінідази (alpha-Nacetylglucosaminidase, Naglu) в такій терапевтично ефективній дозі та з такою періодичністю введення, при яких знижується інтенсивність, тяжкість чи частота або вповільнюється прояв щонайменше одного симптому чи ознаки синдрому Санфіліппо типу В. [0044] У деяких варіантах реалізації, щонайменше один симптом чи ознака Санфіліппо А або Санфіліппо В являє собою втрату слуху, розлад розвитку мови, дефіцит моторних навичок, моторну гіперактивність, прогресуючий розлад пізнавальної функції, агресивність і/або розлад сну. [0045] У деяких варіантах реалізації, рекомбінантний фермент Naglu являє собою гібридний білок, який містить Naglu і частину, яка обумовлює спрямовану доставку до лізосом. У деяких варіантах реалізації, частина, яка обумовлює лізосомну доставку, являє собою IGF-II. [0046] У іншому аспекті даний винахід передбачає способи лікування глобоїдно-клітинної лейкодистрофії (ГКЛ), які включають стадію інтратекального введення суб'єкту, що потребує лікування, рекомбінантної β-галактозидази (recombinant β-galactosidase, GLС) у такій терапевтично ефективній дозі та з такою періодичністю введення, при яких знижується 6 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інтенсивність, тяжкість чи частота або вповільнюється прояв щонайменше одного симптому чи ознаки ГКЛ. У деяких варіантах реалізації, щонайменше один симптом або ознака ГКЛ являє собою дратівливість, судоми, розумову деградацію, глухоту, сліпоту, міоклонічні судоми, надмірний м'язовий тонус, відставання в розвитку, регресію навичок розвитку, підвищену чутливість, тремор, атаксію, спастичність, епізодичну сильну блювоту, лейкодистрофію, церебральну атрофію, розлад розвитку глобоїдних клітин і/або демієлінізацію. [0047] У іншому аспекті даний винахід відноситься до пристроїв для інтратекального введення, які включають порт введення рідини; порожнисту основну частину, яка містить перший отвір для рідини, сполучений із вхідним портом для рідини, і другий отвір для рідини, виконаний із можливістю введення до спинного мозку; і блокуюче пристосування для блокування введення порожнистої основної частини до спинного мозку. У деяких варіантах реалізації, блокуюче пристосування включає одну або більше опуклостей, виконаних на поверхні порожнистої основної частини, і блокуюче кільце, виконане з можливістю установки над однією або більшим числом опуклостей. У деяких варіантах реалізації, порт введення рідини включає резервуар. У деяких варіантах реалізації, порт введення рідини є таким, що імплантується. У деяких варіантах реалізації, порт введення рідини являє собою ін'єкційний порт. У деяких варіантах реалізації, порт введення рідини являє собою механічний насос. [0048] У даній заявці терміни "приблизно" і "близько" є еквівалентними. Мається на увазі, що будь-які числівники, які використовуються в даний заявці з термінами "приблизно/близько" або без них, охоплюють будь-які відхилення, які є звичайними згідно з оцінкою фахівця. [0049] Інші ознаки, завдання й переваги даного винаходу наведені в докладному описі, який наведений нижче. Однак слід розуміти, що зазначені варіанти реалізації даного винаходу наведені тільки як ілюстрації, а не як обмеження. Різні зміни й модифікації в рамках винаходу стануть очевидними для фахівців у даній області з докладного опису. Короткий опис графічних матеріалів [0050] Графічні матеріали наведені тільки для ілюстрації, а не для обмеження. [0051] На Фігурі 1 представлена типова схема пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ) з механізмом безпеки. [0052] На Фігурі 2А представлені приклади ділянок на тілі пацієнта, де може бути розміщений ПІДЛЗ; на Фігурі 2В показані різні компоненти пристрою для інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ), а на Фігурі 2С показані приклади ділянок на тілі пацієнта для ІТ поперекової ін'єкції. [0053] На Фігурі 3 показані показові результати, що підсумовують дані про наповнювачі, протестовані на дорослих мавпах. [0054] На Фігурі 4 показані показові результати, що ілюструють стабільність hGalC при термічному скринінгу hGalC в залежності від pH. [0055] На Фігурі 5 наведені показові результати, що ілюструють специфічну активність hGalC в залежності від рН. [0056] На Фігурі 6 наведені показові результати, що ілюструють результати термічного скринінгу hGalC в залежності від концентрації солі. [0057] На Фігурі 7 наведені показові результати, які ілюструють швидкість осадження потоків GalC і порівнюють різні йонні сили в 5 мМ Na-фосфатному буфері, рН 6,0. Фігура 7А показує показові результати при використанні 50 мМ NaCl і hGalC. Фігура 7В показує показові результати при використанні 500 мМ NaCl і hGalC. Фігура 7D показує показові результати при використанні 150 мМ NaCl і мишачої GalC. [0058] На Фігурі 8 показані показові результати, що ілюструють профіль ППК (площа під кривою) для GalC в залежності від концентрації солі (1 мг/мл GalC, 5 мМ Na-фосфатний буфер, pH 6,0) (вісь Y=s*g(s*); вісь X=s*). [0059] На Фігурі 9 наведені показові результати, що ілюструють серії розведень hGalC в універсальному буфері, рН 6,0 (вісь Y=(1/сведберг); вісь X=s*(сведберг)). [0060] На Фігурі 10 наведені показові результати, що ілюструють профіль ППК для GalC в залежності від рН (1 мг/мл, 3 мМ цитратний, фосфатний і боратний буфери в 50 мМ NaCl). [0061] На Фігурі 11 наведені показові результати, що ілюструють базовий показ при обширному аналізі розподілу (wide distribution analysis, WDA) при найвищих концентраціях при рН 6,0 у 15 мМ фосфаті Na і 150 мМ NaCl. [0062] На Фігурі 12 наведені показові результати, що ілюструють покази при стресі, отримані при WDA-аналізі при найвищих концентраціях при рН 6,0 у 15 мМ фосфаті Na і 150 мМ NaCl. [0063] На Фігурі 13 наведене графічне порівняння й перекривання фонових і стресових зразків GalC. [0064] На Фігурі 14 наведені показові результати, що ілюструють серії розведень hGalC у 7 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 присутності 1 % NaTC. [0065] На Фігурі 15 наведені показові результати, що ілюструють серії розведень hGalC у присутності 1 % NaTC (1,0 мг/мл і 0,3 мг/мл). [0066] На Фігурі 16 наведені показові результати, що ілюструють власну флюоресценцію hGalC (1 мг/мл) у різних буферах і при різних рН. [0067] На Фігурі 17 наведені показові результати, що ілюструють круговий дихроїзм hGalC в залежності від рН. [0068] На Фігурі 18 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці, крові й червоних кров'яних тільцях у самців пацюків Sprague125 Dawley після однократного інтратекального введення дози I-hGalC. [0069] На Фігурі 19 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці, серці, нирках, печінці, легенях, селезінці у самців пацюків Sprague125 Dawley після однократного інтратекального введення дози I-hGalC. [0070] На Фігурі 20 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці, серці, нирках, печінці, легенях, селезінці у самців пацюків Sprague125 Dawley після однократної внутрішньовенної болюсної ін'єкції I-hGalC. [0071] На Фігурі 21 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці, серці, нирках, печінці, легенях, селезінці у самців пацюків SpragueDawley після однократного інтратекального введення дози і внутрішньовенної болюсної ін'єкції 125 I-hGalC. [0072] На Фігурі 22 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці й різних тканинах (жировій тканині (ниркової капсули), наднирниках, кістках (стегнових), м'язовій (скелетній), сідничному нерві) у самців пацюків Sprague-Dawley 125 після однократного інтратекального введення дози I-hGalC. [0073] На Фігурі 23 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці та різних тканинах (жировій тканині (ниркової капсули), наднирниках, кістках (стегнових), м'язовій (скелетній), сідничному нерві) у самців пацюків 125 Sprague-Dawley після однократної внутрішньовенної болюсної ін'єкції I-hGalC. [0074] На Фігурі 24 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці й різних тканинах (жировій тканині (ниркової капсули), наднирниках, кістках (стегнових), м'язовій (скелетній), сідничному нерві) у самців пацюків Sprague-Dawley 125 після однократного інтратекального введення дози й внутрішньовенної болюсної ін'єкції IhGalC. [0075] На Фігурі 25 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці, спинномозковій рідині й інших тканинах у самців пацюків Sprague125 Dawley після однократного інтратекального введення дози I-hGalC. [0076] На Фігурі 26 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці, спинномозковій рідині й інших тканинах у самців пацюків Sprague125 Dawley після однократної внутрішньовенної болюсної ін'єкції I-hGalC. [0077] На Фігурі 27 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці, спинномозковій рідині та тканинах у самців пацюків Sprague-Dawley 125 після однократного інтратекального введення дози й внутрішньовенної болюсної ін'єкції IhGalC. [0078] На Фігурі 28 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці й тканинах у самців пацюків Sprague-Dawley після однократного 125 інтратекального введення дози I-hGalC. [0079] На Фігурі 29 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці й тканинах у самців пацюків Sprague-Dawley після однократної 125 внутрішньовенної болюсної ін'єкції I-hGalC. [0080] На Фігурі 30 наведені показові результати, що ілюструють середні концентрації радіоактивності в сироватці й тканинах у самців пацюків Sprague-Dawley після однократного 125 інтратекального введення дози й внутрішньовенної болюсної ін'єкції I-hGalC. [0081] На Фігурі 31 наведені показові результати, що ілюструють, що ІП введення rmGalC знижує рівень психозину в мозку у мишей twitcher. Дані являють собою середнє значення ± СПС при n=4 миші в групі лікування. [0082] На Фігурі 32 наведені показові результати, що ілюструють збільшення виживаності тільки при терапії тільки з використанням ІЦВ і ІЦВ/ІП rmGalC. [0083] На Фігурі 33 наведені показові результати, які ілюструють, що у мишей twitcher рівень психозину в мозку значно знижується після ІЦВ і ІЦВ/ІП ін'єкції. [0084] На Фігурі 34 наведені показові результати, що ілюструють покращення гістологічних 8 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 маркерів, які спостерігаються у мишей twitcher, оброблених 40 rmGalC. Гліальний фібрилярний кислий білок (ГФКБ) був використаний як маркер астроцитів. Iba 1 був використаний як маркер мікроглії/макрофагів. Лізосомний, пов'язаний із мембраною білок-1 (LAMP-1) був використаний як лізосомний маркер. [0085] На Фігурі 35 наведені показові результати, що ілюструють повторне накопичення психозину після однократної ІЦВ ін'єкції rmGalC або носія. [0086] На Фігурі 36 наведені показові результати, що ілюструють відсоток виживаності мишей twitcher після однократної ІЦВ ін'єкції rmGalC на 19/20 післяпологовий день (ППД). Дані представлено для n=8 у кожній групі. [0087] На Фігурі 37 наведені показові результати, що ілюструють відсоток виживаності мишей, оброблених ІЦВ/ІП з використанням rmGalC і rhGalC. [0088] На Фігурі 38 наведені показові результати, що ілюструють аналіз ходи мишей, які отримували однократну ІЦВ ін'єкцію rmGalC і rhGalC. [0089] На Фігурі 39 наведені показові результати, що ілюструють антигенну відповідь на rmGalC і rhGalC у мишей twitcher. [0090] На Фігурі 40 наведені показові результати, що ілюструють рівень психозину в СМР простих собак і собак, яким вводили rhGalC. [0091] На Фігурі 41 наведені показові результати, що ілюструють ІГХ офарблення ін'єктованої ІТ GalC у головному мозку з використанням поліклональних антитіл групи 1. [0092] На Фігурі 42 наведені показові результати, що ілюструють ІГХ офарблення ін'єктованої ІТ GalC у головному мозку з використанням антитіл групи 2. [0093] На Фігурі 43 наведені показові результати, що ілюструють ІГХ офарблення ІТ ін'єктованої GalC у головному мозку з використанням мишачих моноклональних антитіл. [0094] На Фігурі 44 наведені показові результати, що ілюструють ІГХ офарблення ІТ ін'єктованої GalC у головному мозку з використанням мишачих моноклональних антитіл. [0095] На Фігурі 45 наведені показові результати, що ілюструють ІГХ офарблення ІТ ін'єктованої GalC у печінці з використанням мишачих моноклональних антитіл. [0096] На Фігурі 46 наведені показові результати, що ілюструють ІГХ офарблення ІТ ін'єктованої GalC у печінці з використанням поліклональних антитіл групи 2. [0097] На Фігурі 47 наведені показові результати, що ілюструють середні значення активності GalC у головному мозку. [0098] На Фігурі 48 наведені показові результати, що ілюструють середні значення активності GalC у печінці. [0099] На Фігурі 49 наведені показові результати, що ілюструють імуноофарблення на GalC у головному мозку при 10х збільшенні. [0100] На Фігурі 50 наведені показові результати, що ілюструють імуноофарблення на GalC у головному мозку при 40х збільшенні. [0101] На Фігурі 51 наведені показові результати, що ілюструють офарблення на Iba активованої мікроглії при 40х збільшенні. [0102] На Фігурі 52 наведені показові результати, що ілюструють офарблення на LFB/PAS у головному мозку при 10х збільшенні. [0103] Фігура 53 ілюструє показовий результат ІГХ офарблення на I2S, який демонструє виявлений I2S у нейронах (стрілки) кори великого мозку й мозочка, включаючи шар менінгеальних клітин, які покривають поверхню мозку (стрілки), після інтратекальної ін'єкції 3 доз I2S. ІГХ офарблення на I2S після 2 доз, введених у мозок, було слабшим (фото не показане). Не спостерігали позитивного офарблення на I2S для якого-небудь із типів клітин головному мозку контрольних тварин, яким вводили наповнювач. Збільшення 40х. [0104] На Фігурі 54 показаний приклад зворотного розвитку патології в головному мозку мишей IKO після інтратекально-поперекової ін'єкції I2S. Офарблені Г/Е тканини мозку демонструють численні клітинні вакуолі (стрілки) у контрольних тварин, яким вводили наповнювач. Клітинна вакуолізація зменшена в усьому мозку після 2 доз (фото не показане) і 3 доз, ін'єктованих мишам. Помітне зниження було виявлене після ін'єкції 3 дози. Збільшення 40х. [0105] На Фігурі 54 зображений показовий результат імуногістохімічного офарблення LAMP1, було відмічене суттєве зниження лізосомної активності в мозку після 2 доз (фото не показане) і 3 доз лікування I2S у порівнянні з контрольними тваринами, яким вводили наповнювач. Таке зниження характеризувалося зменшенням кількості LAMP-1-позитивних клітин і невеликою інтенсивністю офарблення у всіх досліджених областях мозку. Збільшення 40х. [0106] На Фігурі 56 наведені показові морфометричні результати порівняння середніх значень LAMP-1-позитивної області серед дикого типу (WT), контрольних мишей (що не отримували лікування) і мишей, яким вводили I2S (2 і 3 дози), у корі головного мозку (Кора), 9 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хвостатому ядрі (ХЯ), таламусі (Т), білій речовині (БР) і мозочку (М), які підтверджують зменшення LAMP-1-позитивного офарблення у всіх оцінених областях мозку. Дані представлені як середні значення ± ст. відх. #=P < 0,05; *=P < 0,01; **=P < 0,001. [0107] На Фігурі 57 наведені показові електронні мікрофотографії клітин головного мозку, які показують покращення патології на ультраструктурному рівні. Нейрони мишей, яким вводили наповнювач, мали пластинчасті включення, структуру типу "зеброїдних тілець" і вакуолі, що містять відкладення в формі гранул (вставка), яких було менше у мишей, яким ін'єктували I2S. Олігодендроцити мишей, які отримували наповнювач, показували великі електроннопросвічуючі запасаючі вакуолі (стрілка), в той час як олігодендроцити мишей, яким ін'єктували I2S, мали мінімальну вакуолізацію. Шкала: у нейронах, 2 мкм; в олігодендроцитах 500 нм. [0108] На Фігурі 58 наведені показові імуногістохімічні результати, які демонструють I2S, виявлені в синусоїдальних клітинах печінки після інтратекальної ін'єкції 3 доз I2S. І2S ІГХ офарблення після 2 дози, введеної в печінку, було слабшим (фото не показане). Не спостерігалося I2S-позитивного офарблення в печінці контрольних тварин, що отримували наповнювач. Збільшення 40х. [0109] На Фігурі 59 наведена типова тканина печінки. Інтенсивна клітинна вакуолізація й аномально висока лізосомна активність показана з використанням Г/Е офарблення, і інтенсивне імуноофарблення на LAMP-1 було виявлене у контрольних тварин, що отримували наповнювач, у порівнянні з WT. Помітне ослаблення клітинної вакуолізації та імуноофарблення на LAMP-1 було виявлене після інтратекального введення 3 і 2 (фото не показане) доз I2S. Офарблення з використанням Г/Е, яке виявило внутрішньоцитоплазматичну вакуолізацію, майже повністю зникало, при цьому спостерігалася практично нормальна структура клітин печінки. Офарблення Г/Е, збільшення 40х; офарблення на LAMP-1, збільшення 20х. [0110] На Фігурі 60 наведені приклади тканин, що представляють головний мозок тваринної групи, яка отримувала дозу 3 мг. I2S-позитивне офарблення спостерігалося в менінгеальних клітинах. Збільшення 4х. [0111] На Фігурі 61 наведені приклади тканин, що представляють головний мозок тваринної групи, яка отримувала дозу 30 мг. I2S-позитивне офарблення спостерігалося в нейронах і менінгеальних клітинах. Збільшення 4х. [0112] На Фігурі 62 наведені приклади тканин, що представляють головний мозок тваринної групи, яка отримувала дозу 100 мг. I2S-позитивне офарблення в нейронах і менінгеальних клітинах було сильнішим, ніж у випадку мишей, що отримували дозу 3 і 30 мг. Збільшення 4х. [0113] На Фігурі 63 наведені приклади тканин, що представляють головний мозок у тваринної групи, яка отримувала дозу 150 мг. Відмічена обширна популяція I2S-позитивних нейронів серед сильно позитивних менінгеальних клітин. [0114] На Фігурі 64 наведені приклади тканин, що демонструють I2S-позитивні нейрони та гліальні клітини, а також менінгеальні клітини всередині I шару головного мозку у тваринної групи, яка отримувала дозу 30 мг. Збільшення 40х. [0115] На Фігурі 65 наведені приклади тканин, що демонструють I2S-позитивні нейрони та гліальні клітини, а також периваскулярні клітини всередині III шару головного мозку у тваринної групи, яка отримувала дозу 30 мг. Збільшення 40х. [0116] На Фігурі 66 наведені приклади тканин, що демонструють I2S-позитивні нейрони та гліальні клітини всередині VI шару головного мозку, які прилягають до білої речовини, у тваринної групи, яка отримувала дозу 30 мг. Збільшення 40х. [0117] На Фігурі 67 наведені приклади тканин, що демонструють сильне I2S-позитивне офарблення нейронів (головний мозок) у тваринної групи, яка отримувала дозу 150 мг. Збільшення 100х. [0118] На Фігурі 68 наведені приклади тканин, що демонструють імуноофарблення на I2S шийного відділу спинного мозку у тваринної групи, яка отримувала дозу 150 мг. Збільшення 4х. [0119] На Фігурі 69 наведені приклади тканин, що демонструють сильне імуноофарблення на I2S поперекового відділу спинного мозку у тваринної групи, яка отримувала дозу 150 мг. Збільшення 4х. [0120] На Фігурі 70 наведені приклади тканин, що демонструють сильне позитивне імуноофарблення на I2S менінгеальних клітин, гліальних клітин і епі/пери/ендоневрію (сполучні клітини) в поперековому відділі у тваринної групи, яка отримувала дозу 150 мг. Збільшення 40х. [0121] На Фігурі 71 наведене зображення, яке демонструє, що нейрони в поперековому відділі спинного мозку в групі тварин, що отримувала дозу 150 мг, були в значній мірі I2Sпозитивними. Збільшення 40х. [0122] На Фігурі 72 наведені показові результати для печінки в групі тварин, що отримувала дозу 3 мг. Тільки синусоїдальні клітини були I2S-позитивними. Збільшення 40х. 10 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0123] На Фігурі 73 наведені показові результати для печінки в групі тварин, що отримувала дозу 30 мг. I2S-позитивними були синусоїдальні клітини й гепатоцити. Збільшення 40х. [0124] На Фігурі 74 наведені показові результати для печінки в групі тварин, що отримувала дозу 100 мг. I2S імуноофарблення було сильним у синусоїдальних клітинах і гепатоцитах. Збільшення 40х. [0125] На Фігурі 75 наведені показові результати для печінки в групі тварин, що отримувала дозу 150 мг. Сильне I2S-позитивне офарблення було виявлене в синусоїдальних клітинах і гепатоцитах. Збільшення 40х. [0126] На Фігурі 76 наведені показові результати для серця в групі тварин, що отримувала дозу 3 мг. Імуноофарблення на I2S було негативним. Збільшення 40х. [0127] На Фігурі 77 наведені показові результати для серця в групі тварин, що отримувала дозу 30 мг. I2S-позитивними були інтерстиціальні клітини. Збільшення 40х. [0128] На Фігурі 78 наведені показові результати для серця в групі тварин, що отримувала дозу 100 мг. I2S-позитивне офарблення було виявлене для інтерстиціальних клітин. Збільшення 40х. [0129] На Фігурі 79 наведені показові результати для серця в групі тварин, що отримувала дозу 150 мг. Було виявлене значне I2S-позитивне офарблення інтерстиціальних клітин. Збільшення 40х. [0130] На Фігурі 80 наведені показові результати для нирки в групі тварин, що отримувала дозу 3 мг. Імуноофарблення на I2S було негативним. Збільшення 40х. [0131] На Фігурі 81 наведені показові результати для нирки в групі тварин, що отримувала дозу 30 мг. I2S-позитивними були клубочкові та інтерстиціальні клітини. [0132] На Фігурі 82 наведені показові результати для нирки в групі тварин, що отримувала дозу 100 мг. Було виявлене посилення I2S-офарблення клубочкових та інтерстиціальних клітин. Збільшення 40х. [0133] На Фігурі 83 наведені показові результати для нирки в групі тварин, що отримувала дозу 150 мг. Виявлене I2S-позитивне офарблення проксимальних трубчастих, клубочкових та інтерстиціальних клітин. Збільшення 40х. [0134] На Фігурі 84 наведені результати імуногістохімічних (ІГХ) досліджень з оцінки тканин ЦНС довгохвостих макак, яким вводили щотижня дози ідуронат-2-сульфатази (I2S). Як було показано методами ІГХ, клітинні відкладення I2S зустрічалися в усій ЦНС. У сірій речовині I2S була виявлена в нейронах головного мозку, мозочка, стовбурі мозку й спинному мозку в усіх групах у залежності від дози. На поверхні сірої речовини груп, що отримували високу дозу, велика кількість нейронів на поверхні кори головного мозку була офарблена I2S-позитивно (на Фігурі 84А). I2S також була виявлена в нейронах таламуса (на Фігурі 84В), гіпокампу (на Фігурі 84С), хвостатого ядра (на Фігурі 84D) і спинного мозку (на Фігурі 84Е). Менінгеальні та периваскулярні клітини були також позитивно офарблені на I2S (на Фігурі 84F). Зазначена шкала відповідає 25 мкм. [0135] На Фігурі 85 наведене графічне порівняння кліренсу ідуронат-2-сульфатази (I2S) у краніальному та спінальному пулах на основі графіка залежності кількості I2S у таких пулах від часу після введення. [0136] На Фігурі 86 показане дозозалежне накопичення в сірій речовині у приматів, відмінних від людини, яким інтратекально вводили ідуронат-2-сульфатазу (I2S) протягом шести місяців. Показана інтенсивність офарблення відповідає накопиченню ідуронат-2-сульфатази в таламусі. На Фігурі 86 ядра контрастовані з використанням DAPI й виглядають синіми, а білок (I2S) виглядає зеленим. [0137] На Фігурі 87 показане дозозалежне накопичення введеної інтратекально ідуронат-2сульфатази (I2S) приматам, відмінним від людини, після однократної ін'єкції й після декількох ін'єкцій протягом шести місяців. Показана інтенсивність офарблення відповідає накопиченню білка I2S в корі головного мозку. [0138] На Фігурі 88 показана клітинна локалізація ідуронат-2-сульфатази (I2S) в головному мозку приматів. На Фігурі 88А представлений поперечний зріз тканин головного мозку, вилучених із головного мозку приматів, а на Фігурі 88В показані окремі області відділів, які відповідають трьом областям тканин білої речовини (позначені як W1, W2 і W3), білої речовини поблизу шлуночка (VW) і поверхневої сірої речовини (СР) зрізу, ідентифікованого на Фігурі 88А. [0139] Фігура 89А-D ілюструє поглинання нейронами й олігодендроцитами і асоціацію аксонів у приматів при інтратекальному введенні ідуронат-2-сульфатази (I2S) після щомісячних ін'єкцій протягом шестимісячного періоду. Зокрема, Фігура 89А, Фігура 89В, Фігура 89С і Фігура 89D ілюструють офарблені волокна в тканинах головного мозку приматів, яким інтратекально вводили ідуронат-2-сульфатазу (I2S), які відповідно співвідносяться з трьома областями білої 11 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 речовини (W1, W2 і W3) і областями поверхні сірої речовини, визначеними на Фігурі 87В. Фігура 89А ілюструє поглинання олігодендроцитами інтратекально введеної до тканини білої речовини I2S. На Фігурі 89В і на Фігурі 89С показане поглинання олігодендроцитами та асоціація аксонів при інтратекальному введенні I2S до тканин білої речовини W2 і W3 відповідно. На Фігурі 89В показане поглинання нейронами інтратекально введеної I2S до тканин на поверхні сірої речовини (СР). [0140] На Фігурі 90 показана клітинна ідентифікація ідуронат-2-сульфатази в білій речовині поблизу шлуночка (VW) у приматів, відмінних від людини (стрілки зверху ліворуч). Як показано на об'єднаному зображенні (стрілки знизу, праворуч), ідуронат-2-сульфатаза не пов'язана з мієліном (зверху праворуч). На Фігурі 90 ядра контрастовані з використанням DAPI (знизу ліворуч), білок (I2S) проявляється зверху ліворуч. [0141] На Фігурі 91 показане офарблення в тканинах здорових собак породи бігль, яким інтрацеребровентрикулярно (ІЦВ) або інтратекально (ІТ) вводили однократну ін'єкцію ідуронат2-сульфатази (I2S). Як показано на зображеннях a-h, I2S була широко розподілена по всій сірій речовині в обох випадках, як у ІТ, так і у ІЦВ груп, що було визначено з використанням імуногістохімії (ІГХ). Зображення а і b показують, що в корі головного мозку нейрони позитивно офарблені на I2S у всіх шести нейронних шарах, від поверхневого молекулярного шару до глибокого внутрішнього шару в обох групах: ІТ та ІЦВ. Зображення с і d ілюструють, що в корі мозочка груп ІТ та ІЦВ I2S виявлена в нейронах, включаючи клітини Пуркіньє. Аналогічно, зображення е і f демонструють, що в обох групах з ІТ та ІЦВ введенням великі популяції нейронів у гіпокампі були позитивно офарблені на I2S. Нарешті, зображення g і h показують, що I2S-позитивні нейрони були також знайдені в таламусі й хвостатому ядрі як у ІТ, так і в ІЦВ групі. На Фігурі 91 офарблення на I2S показане стрілками. [0142] На Фігурі 92 наведена порівняльна ілюстрація тканини мозолистого тіла мишей, нокаутованих ідуронат-2-сульфатазою (IKO), які відносяться до контрольної групи (без обробки) або які отримували I2S інтратекально. Як можна побачити на зображенні, у мишей IKO, які отримували І2S, спостерігалося зниження клітинної вакуолізації, що є характерною рисою деяких лізосомних хвороб накопичення в мозолистому тілі та зводі тканин I2S-оброблених ІКО мишей. [0143] Фігура 93А ілюструє помітне зниження, при присутності лізосомного зв'язаного з мембраною білка 1 (LAMP-1), патологічного маркера лізосомних хвороб у тканинах на поверхні кори мозку оброблених мишей IKO (Фігура 93А) в порівнянні з необробленими контрольними мишами IKO (Фігура 93В) при 20х і 40х збільшенні. [0144] На Фігурі 94 показаний приклад пристрою інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ). [0145] На Фігурі 95 показаний приклад низькопрофільної системи доступу PORT-A-CATH®, яка інтратекально імплантується. [0146] На Фігурі 96 показаний приклад пристрою інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ). [0147] На Фігурі 97 показаний приклад пристрою інтратекальної доставки лікарських засобів (ПІДЛЗ), який дозволяє вводити в домашніх умовах ферменти до ЦНС при замісній ферментній терапії (ЗФТ). [0148] На Фігурі 98 наведена типова ілюстрація, яка демонструє ефект вакуолізації після однієї внутрішньомозкової ін'єкції ідурсульфази до нейронів (клітини Пуркіньє). [0149] Фігура 99 являє собою приклад активності I2S в мозку в залежності від дози та області. [0150] Фігура 100 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад дані з імуногістохімічної локалізації ідурсульфази в різних рівнях кори головного мозку. [0151] Фігура 101 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад активність I2S у спинному мозку мавп після інтратекального введення ідурсульфази. [0152] Фігура 102 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад активність I2S у печінці, серці та нирках мавп після інтратекального введення ідурсульфази. [0153] На Фігурі 103 показана орієнтовна схема програми випробувань із ескалацією дози Hunter-IT. [0154] Фігура 104 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад вимірювання концентрації I2S у різних зрізах тканин мозку після 30 мг дози. Різні криві відповідають різному часу вимірювання. [0155] Фігура 105 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад вимірювання концентрації I2S після тривалого введення з використанням різних шляхів введення й різних концентрацій продукту. 12 UA 115648 C2 124 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0156] На Фігурі 106 наведене PET зображення I-мічена ідурсульфаза-ІТ у мавпах циномолгус при t=5 годин після IV, IT-L або ICV введення. [0157] Фігура 107 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад дані з концентрації ASA у сироватці після внутрішньовенного введення. [0158] Фігура 108 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад дані з концентрації ASA в сироватці після ІТ поперекового введення. [0159] Фігура 109 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад дані з концентрації ASA в спинномозковій рідині після внутрішньовенного введення. [0160] Фігура 110 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад дані з концентрації ASA в спинномозковій рідині після ІТ поперекового введення. [0161] На Фігурі 111 наведена типова мікрофотографія тканин мозку, мозкових оболонок, інфільтратів (групи з середніми й високими дозами, обидві статі) після лікування. [0162] На Фігурі 112 наведена інша типова мікрофотографія тканин мозку, мозкових оболонок, інфільтратів (групи з середніми й високими дозами, обидві статі) після лікування. [0163] На Фігурі 113 наведена типова мікрофотографія тканин мозку, периваскулярних тканин, інфільтратів (групи з середніми дозами, чоловіки; групи з високими дозами, жінки) після лікування. [0164] На Фігурі 114 наведене показове офарблення, з використанням альціанового синього, спинного мозку імунотолерантних мишей MLD, які отримували rhASA1, і результати, що демонструють зменшення сульфатидів, яке було визначено шляхом офарблення, з використанням альціанового синього, шийного відділу спинного мозку у тварин, які отримали інтратекальні ін'єкції rhASA на 1, 8, 15 і 22 дні в дозі 520 мг/кг ваги мозку, або контрольних мишей, яким вводили наповнювач. Як показано, обробка шляхом інтратекального введення rhASA призводила до зниження накопичення сульфатидів у спинному мозку, утому числі в шийному відділі спинного мозку. [0165] Фігура 115 ілюструє показовий морфометричний аналіз офарблення, з використанням альціанового синього, відділів хребта у імунотолерантних мишей MLD, оброблених rhASA, і результати, що ілюструють оптичну щільність альціанового синього в усьому спинному мозку (Тспинний мозок), усій сірій речовині (Т-СР), сірій речовині поперекового відділу (L-СР), сірій речовині шийного відділу (С-СР), усій білій речовині (Т-БР), білій речовині поперекового відділу (L-БР) і білій речовині шийного відділу (С-БР), як визначено з використанням морфометричного аналізу. Статистично значуще зменшення офарблення, показане офарбленням альціановим синім, було виявлене у тварин, оброблених rhASA, в порівнянні з контрольними мишами, яким вводили наповнювач. [0166] На Фігурі 116 показане типове зменшення офарблення на LAMP у білій речовині (фімбрія) імунотолерантних мишей MLD, оброблених rhASA, наведені показові результати, які ілюструють рівень LAMP-1 у бахромці, визначений із використанням імуногістохімії. Збільшення 20х. Показано, що обробка шляхом інтратекального введення rhASA призводила до зменшення LAMP-1 у білій речовині головного мозку. [0167] На Фігурі 117 наведені результати типового морфометричного аналізу офарблення на LAMP тканин мозку імунотолерантних мишей MLD, що отримували rhASA1, і результати, які ілюструють інтенсивність офарблення на LAMP-1 у мозолистому тілі (СС), бахромці (F), білій речовині мозочка (CB-БР) і стовбурі мозку (BS) тварин, що отримували 20 мг/кг ваги мозку внутрішньовенно rhASA, 300 мг/кг ваги мозку інтратекально rhASA, 520 мг/кг ваги мозку внутрішньовенно rhASA, або контрольних мишей, яким вводили наповнювач. [0168] Фігура 118 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію ASA у фрагментах тканин мозку молодих довгохвостих макак (Cynomolgus), яким вводили наповнювач, після введення один раз на два тижні (РДТ) протягом 6 місяців (загальна некропсія). [0169] Фігура 119 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію ASA у фрагментах тканин мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення РДТ rhASA1, 1,8 мг/доза, протягом 6 місяців (загальна некропсія). [0170] Фігура 120 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію ASA у фрагментах тканин мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення РДТ rhASA1, 0,6 мг/доза, протягом 6 місяців (загальна некропсія). [0171] Фігура 121 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення РДТ rhASA1, 18,6 мг/доза, протягом 6 місяців (загальна некропсія). [0172] Фігура 122 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення РДТ (ФСБ як 13 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 контроль) протягом 6 місяців (загальна некропсія). [0173] Фігура 123 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення РДТ наповнювача протягом 6 місяців (загальна некропсія). [0174] Фігура 124 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення РДТ rhASA1, 1,8 мг/доза, протягом 6 місяців (загальна некропсія). [0175] Фігура 125 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення РДТ rhASA1, 6,0 мг/доза, протягом 6 місяців (загальна некропсія). [0176] Фігура 126 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA у фрагментах тканин мозку молодих довгохвостих макак після ІТ введення РДТ rhASA1, 18,6 мг/доза, протягом 6 місяців (загальна некропсія). [0177] Фігура 127 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA в обраних фрагментах тканин мозку, взятих із поверхні мозку тварин з контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,8 мг, 6,0 мг і 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, всі інші дані отримані при загальній некропсії). [0178] Фігура 128 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA в обраних фрагментах тканини з глибокої білої речовини мозку тварин з контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,8 мг, 6,0 мг і 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, всі інші дані отримані при загальній некропсії). [0179] Фігура 129 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA в обраних фрагментах тканини з глибокої сірої речовини мозку тварин із контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,8 мг, 6,0 мг і 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, всі інші дані отримані при загальній некропсії). [0180] Фігура 130 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA в обраних фрагментах тканини з різних областей мозку тварин з контрольним пристроєм, тварин, яким вводили наповнювач, 1,8 мг, 6,0 мг і 18,6 мг (самці й самки розділені, контрольні дані для експерименту з пристроєм являють собою дані, отримані при прижиттєвому розтині, всі інші дані отримані при загальній некропсії). [0181] Фігура 131 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA у відділах хребта молодих довгохвостих макак після ІТ введення РДТ протягом 6 місяців (прижиттєвий розтин). [0182] Фігура 132 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрацію rhASA в печінці молодих довгохвостих макак після ІТ введення РДТ протягом 6 місяців (047-021) (прижиттєвий розтин). [0183] Фігура 133 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад анатомічне положення фрагментів тканин мозку в підкірковій БР (білій речовині), перивентрикулярній БР (і в глибокій білій речовині) і підкірковій БР. [0184] Фігура 134 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад анатомічне положення фрагментів тканин мозку в мозолистому тілі й підкірковій навколомозолистій БР, внутрішній капсулі – Gpi, внутрішній капсулі-хвостатому ядрі, глибокій білій речовині, підкірковій БР і корі, шкарлупі й тимчасовій підкірковій БР і корі. [0185] Фігура 135 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад анатомічне положення фрагментів тканин мозку в глибокій сірій речовині, глибокій БР (фронтальних перивентрикулярних і підкіркових) і підкірковій білій речовині й корі – поверхово сагітально. [0186] Фігура 136 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад анатомічне положення фрагментів тканин мозку в мозолистому тілі й підкірковій навколомозолистій БР, глибокій підкірковій БР, глибокій сірій речовині, перивентрикулярній БР, підкірковій БР і гіпокампі. [0187] Фігура 137 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад анатомічне положення фрагментів тканин мозку в глибокій БР мозолистого тіла. [0188] Фігура 138 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад анатомічне положення фрагментів тканин мозку в підкірковій БР – потиличної долі та білої речовини мозочка, включаючи зубчасті ядра (БР). [0189] Фігура 139А ілюструє концентрацію рекомбінантної людської арилсульфатази (ASA) у виділених фрагментах тканин мозку дорослих і молодих довгохвостих макак, яким ін'єктували 14 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 або наповнювач, або 1,8 мг rhASA чи 18,6 мг rhASA. Кожна з Фігур 139А-G відповідає області тканини мозку, показаної на Фігурі 134. [0190] Фігура 140А і Фігура 140В є типовими ілюстраціями, які показують порівняння концентрацій рекомбінантної людської арилсульфатази А (ASA), визначеної в глибокій білій (Abuehf 140A) або в глибокій сірій (Фігура 140В) речовині мозку дорослих чи молодих довгохвостих макак, які отримували інтратекальні або інтрацеребровентрикулярні ін'єкції rhASA. [0191] Фігура 141А представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад концентрації ASA, визначені в декількох фрагментах тканин, отриманих у молодих (12 місяців від народження) довгохвостих макак, які отримували інтратекальні ін'єкції 18,6 мг рекомбінантної людської арилсульфатази А (rhASA). Як показано на обох Фігурах 140А-В, концентрація ASA, доставленої до тканин, була в межах або перевищувала необхідну терапевтичну концентрацію 2,5 нг/мг rhASA. Анатомічними областями тканин мозку, які відповідають зразкам тканини, показаним на Фігурі 140А і Фігурі 140В, є: підкіркова біла речовина (1); перивентрикулярна біла речовина і глибока біла речовина (2); підкіркова біла речовина (3); підкіркова біла речовина (4); внутрішня капсула (5); хвостате ядро внутрішньої капсули (6); глибока біла речовина (7); підкіркова біла речовина і кора (8); шкарлупа (9); підкіркова біла речовина і кора скроневої долі (10); глибока сіра речовина (11); глибока сіра речовина (12); перивентрикулярна і підкіркова лобова доля (13); підкіркова біла речовина, кіркова поверхнева речовина (14); мозолисте тіло і навколомозолиста підкіркова біла речовина (15); глибока підкіркова біла речовина (16); глибока сіра речовина (17); глибока сіра речовина (18); перивентрикулярна біла речовина (19); глибока підкіркова біла речовина (20); гіпокамп (21); мозолисте тіло (22); глибока біла речовина (23); підкіркова біла речовина, потилична доля (24); і біла речовина мозочка (25). [0192] На Фігурі 142А показані ділянки тканин глибокої білої речовини, отриманої від довгохвостих макак, які отримували інтратекальні ін'єкції 1,8 мг ASA. Фігура 142В ілюструє імуноофарблення тканин глибокої білої речовини й розподіл ASA у відповідних клітинах. На фігурі 142В білок (ASA) показаний у правому нижньому вікні. Фігура 142С ілюструє, що ІТ введена ASA демонструє органельну колокалізацію в тканинах глибокої білої речовини у довгохвостих макак і, зокрема, у лізосомах. На Фігурі 142С у верхньому лівому вікні показане імуноофарблення на ASA. 124 [0193] На Фігурі 143 наведене порівняння розподілу I-міченої арилсульфатази (ASA) з використанням ПЕТ-сканування через 24 години після ІТ або ІЦВ введення довгохвостим мавпам ASA, міченої зазначеним способом. 124 [0194] На Фігурі 144 наведене порівняння розподілу I-міченої ASA відразу після ІЦВ 124 введення довгохвостим мавпам і порівняння розподілу ІТ введеної I-міченої ASA протягом 2-5 124 годин. Як показано, ІТ введення доставляє I-мічену ASA до тих самих початкових відділів (цистерна і проксимальний відділ хребта), як це показано для ІЦВ введення. [0195] На Фігурі 145 наведені результати типового ІЦВ та ІТ введення на моделі миші. [0196] На Фігурі 146 наведені показові результати, що ілюструють концентрацію HNC у СМР в залежності від часу в дозах 1,5, 4,5 і 8,3 мг після 6 місяців приймання. На Фігурі 146В більш детально показаний показовий результат, який ілюструє концентрацію антитіл до HNS у СМР після 6 місяців ІТ введення 1,5, 4,5 і 8,3 мг доз мавпам. Дані для самців і самок об'єднані. На Фігурі 146С більш детально показаний показовий результат, який ілюструє концентрацію антитіл до HNS у СМР після 6 місяців ІТ введення 1,5, 4,5 і 8,3 мг доз мавпам після 6 місяців введення. Дані для самців і самок об'єднані. Два найбільш високі значення концентрації (32,205 нг/мл і 15,467 нг/мл), доставлені ІТ дозою 6, 8,3 мг HNS, були виключені з графіка, оскільки проби СМР не були взяті перед введенням дози 6. [0197] На Фігурі 147 наведені результати, що демонструють показові зображення зрізів тканин мозкових оболонок і паренхіми мозку, офарблених гематоксиліном і еозином. На Фігурі 147А наведений показовий результат, що ілюструє вид при малому збільшенні нейтрофільних інфільтратів локальних ІТ катетерів у мавп DC. На Фігурі 147В наведений показовий результат, що ілюструє вид при великому збільшенні еозинофільних інфільтратів у мозкових оболонках мавп, які отримували високі дози (8,3 мг/доза); загальна тяжкість інфільтратів була схожа зі значенням для групи з середньою дозою (4,5 мг/доза) (не показано). На Фігурі 147С наведений показовий результат, що ілюструє вид при великому збільшенні для мавп, які отримували низьку дозу (1,5 мг/доза), показані еозинофіли в периваскулярному просторі (паренхіма мозку). На Фігурі 147D наведений показовий результат для групи мавп, які отримували низьку дозу (1,5 мг/доза), показані еозинофіли в периваскулярному просторі й прилягаючій паренхімі. На Фігурі 147Е наведений показовий результат, що ілюструє еозинофіли в паренхімі спинного мозку (показані стрілками) для групи тварин, які отримували низьку дозу; нейрони в цій області є нормальними. На Фігурі 147F наведений показовий результат, що ілюструє еозинофіли й 15 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 область мікроглії (стрілки вказують на еозинофіли; рамкою показана область мікроглії) у групи мавп, які отримували низьку дозу (1,5 мг/доза). У цій області виявлено кілька нейронів, усі з них є нормальними. Масштабна лінійка: 200 мкм. [0198] На Фігурі 148 наведений показовий результат, що ілюструє активність ферменту HNS у спинному мозку й головному мозку мавп. На Фігурі 148А/В наведений показовий результат, що ілюструє активність у спинному мозку (A) самців і (В) самок мавп. Зріз 3 = поперековий відділ, зрізи 3, 6 = грудний відділ і зріз 9 = шийний відділ; 0 = голівка катетера. На Фігурі 148С/D наведений показовий результат, що ілюструє активність HSN у мозку (С) самців і (D) самок мавп. Зрізи пронумеровані від голови до хвоста (від 3 до 15). Усі зразки тканин були зібрані приблизно після 24 годин після останнього приймання або після 4 тижнів після останнього приймання, потрібних для відновлення тварин. DC, контрольне спостереження. Дані являють собою середнє значення ± стандартна помилка середнього при n=4 мавп у групі лікування. [0199] На Фігурі 149 наведений показовий результат, що ілюструє активність ферменту HNS у головному мозку й печінці мавп. На Фігурі 149А наведений показовий результат, що ілюструє розподіл активності HSN у мозку в групі мавп, які отримували високу дозу (8,3 мг/доза). Показані кратні зміни активності в поверхневих, глибоких і дуже глибоких (перивентрикулярних) областях мозку в порівнянні з ендогенним рівнем (група DC). Усі зразки тканин були зібрані приблизно через 24 години після введення останньої дози або через 4 тижні після приймання останньої дози для групи тварин з відновленням. Дані являють собою середнє значення ± стандартна помилка середнього при n=6 мавп (обидві статі), зрізи мозку 6 і 9. Дані для двох мавп не були включені; при некропсії на катетерах не виявили мітки. На Фігурі 149В показана активність HNS у печінці мавпи. Усі зразки тканин були зібрані приблизно через 24 години після приймання останньої дози або через 4 тижні після приймання останньої дози для групи тварин з відновленням. DC, контрольне спостереження. Rec, група тварин, які видужали. Дані являють собою середнє значення ± стандартна помилка середнього при n=4 мавп у групі, за винятком групи самок, які отримували низьку дозу (4,5 мг/доза) (n=3). [0200] На Фігурі 150 наведений показовий результат, що ілюструє локалізацію HNS у мозочку молодих довгохвостих макак: 3-місячна когорта. На Фігурі 150А наведений показовий результат, що ілюструє відсутність імуноофарблення на HSN у мозочку контрольних тварин, які отримували наповнювач (0 мг/доза); збільшення 20х. На Фігурі 150В наведений показовий результат, що ілюструє офарблення в мозочку групи тварин, які отримували низьку дозу (1,5 мг/доза), і показує мінімальне позитивне офарблення, обмежене молекулярним шаром; збільшення 20х. На Фігурі 150С наведений показовий результат, що ілюструє офарблення в мозочку групи тварин, які отримували середню дозу (4,5 мг/доза), і показує мінімальне офарблення в зовнішньому зернистому шарі; збільшення 20х. На Фігурі 150D наведений показовий результат, що ілюструє офарблення в мозочку групи тварин, які отримували високу дозу (8,3 мг/доза), яке охоплює молекулярний, зовнішній зернистий шари й клітини Пуркіньє; збільшення 20х. [0201] На Фігурі 151 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у 124 головній області в залежності від часу в перші 20 хвилин після ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг. [0202] На Фігурі 152 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у мозку 124 в залежності від часу після ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг. [0203] На Фігурі 153 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS в 124 області мозку в залежності від часу після ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг. [0204] На Фігурі 154 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у 124 головній області в залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг. [0205] На Фігурі 155 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у 124 проксимальному відділі хребта в залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг. [0206] На Фігурі 156 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у 124 серединному відділі хребта в залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг. [0207] На Фігурі 157 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у 124 дистальному відділі хребта в залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг. [0208] На Фігурі 158 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у 124 печінці в залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг. [0209] На Фігурі 159 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у мозку 124 в залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг, індивідуальні значення (вгорі) і середнє ± ст. відх. (внизу). [0210] На Фігурі 160 наведений показовий результат вимірювання печінкової концентрації 124 HNS у залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг, індивідуальні значення (вгорі) і середнє ± ст. відх. (внизу). 16 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0211] На Фігурі 161 наведений показовий результат вимірювання печінкової концентрації 124 HNS в залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг, індивідуальні значення (вгорі) і середнє ± ст. відх. (внизу). [0212] На Фігурі 162 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у серці 124 в залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг, індивідуальні значення (вгорі) і середнє ± ст. відх. (внизу). [0213] На Фігурі 163 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS в 124 залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг, індивідуальні значення (вгорі) і середнє ± ст. відх. (внизу). [0214] На Фігурі 164 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у мозку 124 в залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг (угорі) і порівняння некомпартменталізованих ФК параметрів у мозку (внизу). [0215] На Фігурі 165 наведений показовий результат вимірювання концентрації HNS у 124 печінці в залежності від часу ІТ введення I-HNS 1 і 10 мг/кг (угорі) і порівняння некомпартменталізованих ФК параметрів у печінці (внизу). [0216] На Фігурі 166 показані показові первинні фібробласти нормальної людини, використані для вивчення клітинної інтерналізації rhNaglu і Naglu-IGFII. Клітинне поглинання rhNaglu було мінімальним, у той час як клітинне поглинання Naglu-IGFII було дуже яскраво вираженим. Крива насичення інтерналізації Naglu-IGFII свідчить про рецептор-опосередковане поглинання. Таке поглинання інгібувалося з використанням IGFII, але не з використанням маноза-6-фосфату. [0217] На Фігурі 167 наведені показові результати дослідження з використанням конфокальної мікроскопії зразків з використанням фібробластів суб'єкта з хворобою Санфіліппо В (GM01426). Спостерігали обширну інтерналізацію Naglu-IGFII та колоколізацію Naglu-IGFII з LAMP-1. [0218] Фігура 168 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад активність Naglu в дикому типі (WT), в Naglu-/- (KO) і в гетерозиготних Naglu+/- (Het) мишах. Загальну недостатність Naglu у мишей із хворобою Санфіліппо В спостерігали в мозку, печінці, нирках і селезінці. [0219] На Фігурі 169 наведений верхній і боковий вид мозку миші, на якому відмічене місце інтрацистернальної ін'єкції (ІІ) та зрізів для гістологічного аналізу. Серединна мікрографія, поперечний зріз мозку миші переглядали при 1х збільшенні. На нижній мікрографії рамкою виділене поле при 4х збільшенні мікроскопічного зображення. Нижня мікрографія, 4х збільшення гістологічного зрізу. Рамки А і В показують поле при 40х збільшенні мікроскопічного зображення на Фігурі 170 і Фігурі 171. [0220] На Фігурі 170 наведений показовий результат імуногістохімічного офарблення кори головного мозку у мишей із хворобою Санфіліппо В на 7 день після інтрацистернальної ін'єкції (ІІ) при збільшенні 40х. Як rhNaglu, так і Naglu-IGFII демонструють велике клітинне поглинання в нейронах, а також у гліальних клітинах; розподіл і патерн клітинного поглинання був дуже схожим для двох білків (моноклональні антитіла до людського Naglu). [0221] На Фігурі 171 наведене типове імуноофарблення на LAMP-1 кори головного мозку при збільшенні 40х. У порівнянні з мозком миші дикого типу підвищення лізосомних відкладень спостерігали в мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, які отримували наповнювач, як показано з використанням збільшення позитивних плям при імуноофарбленні на LAMP-1. Обробка мозку як rhNaglu, так і Naglu-IGFII мишей із хворобою Санфіліппо В призводила до зменшення лізосомного накопичення, що було схожим із результатом, отриманим для мишей WT. [0222] Фігура 172А ілюструє обширне зменшення клітинної вакуолізації в тканинах білої речовини Naglu-дефіцитних мишей, які отримували інтратекальні ін'єкції Naglu, відносно даних для таких же Naglu-дефіцитних мишей, яким вводили наповнювач. Фігура 172В ілюструє помітне зменшення імуноофарблення лізосомного зв'язаного з мембраною білка 1 (LAMP-1) у тканинах білої речовини Naglu-дефіцитних мишей, які отримували інтратекальні ін'єкції Naglu, в порівнянні з такими ж Naglu-недостатніми мишами, яким вводили наповнювач. [0223] На Фігурі 173 наведені кількісні дані й порівняння концентрації LAMP, виміряного в корі головного мозку, хвостатому ядрі й шкарлупі (CP), таламусі (TH), мозочку (CBL) і білій речовині (БР) Naglu-дефіцитних мишей, яким вводили Naglu, в порівнянні з мишами дикого типу і Naglu-недостатніми мишами, яким вводили наповнювач. LAMP-позитивні області в кожному районі проаналізованої тканини мозку надалі зменшувалися після інтратекального введення трьох доз Naglu протягом семиденного курсу (Фігура 173А) в порівнянні з 2 дозами Naglu протягом двотижневого курсу (Фігура 173В). [0224] На Фігурі 174 показана середньосагітальна анатомічна схема ЦНС людини, яка 17 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наведена для того, щоб указати місце ІТ ін'єкції у канюльованих пацюків дикого типу. Стрілки показують орієнтовне анатомічне розташування ІТ ін'єкції в спинний мозок, звідки брали тканини для імуногістохімічного дослідження. [0225] На Фігурі 175 показана типова активність Naglu в мозку після ІТ ін'єкції. Активність Naglu була значно вища в мозку пацюків дикого типу, які отримували ін'єкції Naglu-TAT і NagluIGFII. [0226] На Фігурі 176 наведені типове імуноофарблення на Naglu кори головного мозку канюльованих пацюків дикого типу, які отримували rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII, Naglu-kif і PerT-Naglu через 24 годин після ІТ ін'єкції, збільшення 20х. Naglu-IGFII був єдиним білком, який показує широке поширення в паренхімі мозку. Клітинне поглинання до нейронів та гліальних клітин відмічене у пацюків, які отримували Naglu-IGFII. З іншого боку, у мишей, оброблених rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-kif і PerT-Naglu, білок зберігався в мозкових оболонках (М). [0227] На Фігурі 177 показані зрізи, наведені на Фігурі 176, при більш високому збільшенні. Верхня панель: у канюльованих пацюків дикого типу, які отримували rhNaglu, rhNaglu зберігається в мозкових оболонках, позитивне офарблення в паренхімі мозку не виявлене. Нижня панель: у канюльованих пацюків дикого типу, які отримували Naglu-IGFII, спостерігали широке поширення в паренхімі мозку і спостерігали клітинне поглинання нейронами та гліальними клітинами. [0228] На Фігурі 178 показаний приклад активності Naglu в мозку і печінці через 24 години після останньої ін'єкції. Серед трьох оброблених груп не виявлено значних відмінностей активності Naglu в мозку, як і активності Naglu в печінці. Цей результат показує, що активність Naglu, виявлена в мозку і печінці, обумовлена багато в чому останньою ін'єкцією, яку проводили за 24 години до умертвіння. [0229] На Фігурі 179 показаний загальний вміст ГАГ у мозку і печінці після ІТ ін'єкції NagluIGFII. Було виявлено прогресуюче збільшення загального вмісту ГАГ у мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, яким вводили наповнювач, що відображає накопичувальний ефект із збільшенням віку мишей із Санфіліппо В. Статистично значуще зниження ГАГ у мозку спостерігали в групах, які отримували по три ін'єкції (p < 0,05). Статистично значуще зниження ГАГ у мозку спостерігали в групах, які отримували по дві й три ін'єкції (p < 0,05). Феномен більш швидкої та більш різкої зміни рівня ГАГ у печінці, ніж у мозку, також спостерігали при ІТ доставці I2S при синдромі Хантера. [0230] На Фігурі 180 наведений показовий результат аналізу біорозподілу Naglu в мозку мишей із Санфіліппо В після ІТ ін'єкції. Імунофлуоресцентне офарблення на Naglu виявило білок Naglu-IGFII в мозкових оболонках (М) і паренхімі мозку. Клітинне поглинання спостерігали в групах, які отримували по дві та три ін'єкції. G: гліальні клітини. [0231] Фігура 181 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад коронарний зріз мозку миші. Рамками виділені області, для яких проводили імуноофарблення на LAMP-1. Для аналізу ступеня поширення білка й ефективності для імуноофарблення на LAMP-1 були обрані кора головного мозку й підкіркові тканини, такі як хвостаті ядра, таламус і біла речовина. [0232] Фігура 182 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад імуноофарблення на LAMP-1 кори головного мозку при 40х збільшенні. У порівнянні з мозком миші дикого типу збільшення лізосомних відкладень спостерігали в мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, яким вводили наповнювач, про що свідчать збільшені LAMP-1-позитивні плями. Зменшення лізосомних відкладень після ІТ ін'єкції Naglu-IGFII було видним на основі зменшення розміру позитивних плям у мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, які отримували по дві ін'єкції, і зменшення розміру та кількості позитивних плям у мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, які отримували по три ін'єкції. [0233] Фігура 183 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад імуноофарблення на LAMP-1 хвостатого ядра, підкіркових ядер (збільшення 40х). Аналогічно тому, що спостерігалося в корі головного мозку, підвищення лізосомних відкладень спостерігали в мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, яким вводили наповнювач, як показано з використанням збільшення імуноофарблених LAMP-1-позитивних плям. На скорочення лізосомних відкладень після ІТ ін'єкції Naglu-IGFII вказує зменшення розміру позитивних плям у мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, які отримували по дві ін'єкції, і зменшення розміру та кількості позитивних плям у мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, які отримували по три ін'єкції. [0234] Фігура 184 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад імуноофарблення на LAMP-1 таламуса, ядер середнього мозку (збільшення 40х). На скорочення лізосомних відкладень після ІТ ін'єкції Naglu-IGFII вказує зменшення розміру позитивних плям у мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, які отримували по дві ін'єкції, і зменшення розміру та кількості позитивних плям у мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, які отримували по три ін'єкції. 18 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0235] Фігура 185 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад імуноофарблення на LAMP-1 білої речовини (збільшення 40х). Поздовжня доріжка з волокон аксонів відокремлює білу речовину від сірої речовини, показаної на Фігурах 181-184. Проте, той самий патерн збільшення лізосомного накопичення спостерігали в мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, яким вводили наповнювач, у порівнянні з мишами дикого типу. Про зменшення лізосомного накопичення після ІТ ін'єкції Naglu-IGFII свідчить зменшення розміру та кількості позитивних плям у мозку мишей із хворобою Санфіліппо В, які отримували по дві та три ін'єкції. [0236] Фігура 186 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад імуноофарблення на LAMP-1 кори мозочка. Морфологію кори мозочка можна бачити з високої щільності зернистих нейронів, гіпоклітинного молекулярного шару і одинарного шару нейронів Пуркіньє між зернистими нейронами та молекулярним шаром. Нейрони Пуркіньє були ідентифіковані за великою цитоплазмою та невеликою кількістю дендритів, які проникають до молекулярного шару. [0237] Фігура 187 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад імуноофарблення на Naglu в головному мозку, спинному мозку і печінці. У головному мозку і спинному мозку ін'єктований Naglu був виявлений із використанням ІГХ тільки в мозкових оболонках (М), у інших областях Naglu-позитивне офарблення не було виявлене. У печінці синусоїдальні клітини (S) були Naglu-позитивними, а в гепатоцитах не було відмічене поглинання Naglu. [0238] Фігура 188 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад імуноофарблення на LAMP і офарблення печінки та спинного мозку з використанням Г/Е. У порівнянні з тваринами, які отримували наповнювач, офарблення на LAMP було зменшене як у печінці, так і в спинному мозку у мишей, які отримували Naglu. Офарблення з використанням Г/Е показало, що клітинна вакуолізація в гепатоцитах була зменшена в групі лікування в порівнянні з тваринами, які отримували наповнювач. [0239] Фігура 189 представляє ілюстрацію, яка демонструє як приклад офарблення з використанням Г/Е тканин головного мозку і покращення морфології головного мозку після 6 ІТ ін'єкцій Naglu один раз на два тижні (РДТ) протягом 3 місяців. У обробленому головному мозку клітинна вакуолізація (показана стрілками) в усіх досліджених областях зменшена в порівнянні з групою тварин, які отримували наповнювач. [0240] Фігура 190A і Фігура 190B являють собою показові ілюстрації, які показують імуноофарблення на LAMP у різних областях мозку після 6 ІТ ін'єкцій Naglu протягом 3 місяців. У порівнянні групою з тварин, що отримували наповнювач, ІТ ін'єкції Naglu у мишей із хворобою Санфіліппо В призводили до зниження лізосомної активності в усіх досліджених областях, виявлених імуноофарбленням на LAMP. Таке зниження характеризувалося зменшенням числа LAMP-позитивних клітин, меншим розміром клітин і менш інтенсивним офарбленням. Помітне зниження було виявлене в областях мозочка і стовбура мозку, розташованих у області хвостатого ядра мозку, близької до спинного мозку в порівнянні з іншими областями мозку. Явне зниження було також виявлене в глибоких областях мозку, в тому числі в білій речовині, гіпокампі й таламусі. [0241] Фігура 191A і Фігура 191B являють собою показові ілюстрації, що показують ІГХ офарблення на Iba різних областей мозку після 6 ІТ ін'єкцій Naglu протягом 3 місяців, що призводить до активації клітин мікроглії. У порівнянні з групою тварин, що отримували наповнювач, у групі тварин, що отримувала Naglu, не спостерігали зменшення кількості позитивних клітин та інтенсивності офарблення. Однак клітинна морфологія позитивних клітин змінювалася зі зменшенням клітинного розміру в усіх досліджених областях мозку в порівнянні з великими й вакуолізованими клітинами в групі тварин, що отримувала наповнювач (вставки). [0242] Фігура 192А і Фігура 192В являють собою показові ілюстрації, що показують ІГХ на GFAP у різних областях мозку після 6 ІТ ін'єкцій Naglu протягом 3 місяців, що призводить до активації астроцитів. У порівнянні з групою тварин, що отримували наповнювач, GFAPпозитивне офарблення було зменшене в мозочку та стовбурі мозку і дещо зменшене в інших досліджених областях. Визначення [0243] Для полегшення розуміння даного винаходу нижче надані визначення деяких термінів. Додаткові визначення наступних термінів та інші терміни наведені в тексті опису. [0244] Приблизно або близько: У даній заявці термін "приблизно" або "близько" стосовно одного або більше розглянутих значень відноситься до значення, яке є близьким до зазначеного еталонного значення. У деяких варіантах реалізації термін "приблизно" або "близько" відноситься до діапазону значень, які входять до діапазону 25 %, 20 %, 19 %, 18 %, 17 %, 16 %, 15 %, 14 %, 13 %, 12 %, 11 %, 10 %, 9 %, 8 %, 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % або менше в будь-якому напрямку (більше або менше) від установленого еталонного значення, 19 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 якщо не зазначено інше або інше не є очевидним із контексту (окрім випадків, коли таке значення перевищує 100 % від можливого значення). [0245] Покращення: У даній заявці "покращення" означає попередження, скорочення або тимчасове полегшення стану, або покращення стану суб'єкта. Покращення включає, але не обов'язково, повне видужання або повне попередження хворобливого стану. У деяких варіантах реалізації, покращення включає підвищення рівнів відповідного білка або його активності, які є недостатніми у відповідних хворих тканинах. [0246] Біологічна активність: У даній заявці вираз "біологічна активність" відноситься до характеристики будь-якого агента, який має активність у біологічній системі й, зокрема, в організмі. Наприклад, агент, який при введенні до організму демонструє біологічний вплив на організм, вважається біологічно активним. У конкретних варіантах реалізації, у випадках, коли білок або поліпептид є біологічно активним, ту частину білка або поліпептиду, яка має щонайменше один вид біологічної активності білка або поліпептиду, як правило, називають "біологічно активною" частиною. [0247] Наповнювач: У даній заявці термін "наповнювач" відноситься до сполуки, яка додає маси ліофілізованій суміші та вносить вклад у фізичну структуру ліофілізованої таблетки (наприклад, полегшує виробництво по суті однорідної ліофілізованої таблетки, яка підтримує структуру з відкритими порами). Приклади таких наповнювачів включають манітол, гліцин, хлорид натрію, гідроксиетилкрохмаль, лактозу, сахарозу, трегалозу, поліетиленгліколь і декстран. [0248] Катіон-незалежний маноза-6-фосфатний рецептор (CI-MRP): У даній заявці термін "катіон-незалежний маноза-6-фосфатний рецептор (CI-MRP)” відноситься до клітинних рецепторів, які зв'язують фрагменти маноза-6-фосфату на попередниках кислих гідролаз у апараті Гольджи, призначених для транспорту до лізосом. На додаток до маноза-6-фосфатів, CI-MRP також зв'язує інші білки, у тому числі IGF-II. CI-MRP також відомий як рецептор "M6P/IGF-II", рецептор "CI-MRP/IGF-II", "рецептор IGF-II" або "рецептор IGF2". Ці терміни і їхні скорочення використовуються в даній заявці взаємозамінно. [0249] Супутня імунопригнічуюча терапія: У даній заявці термін "супутня імунопригнічуюча терапія" включає будь-які способи імунопригнічуючої терапії, які використовуються як попереднє лікування, прекондиціювання або паралельно зі способом лікування. [0250] Розчинник: У даній заявці термін "розчинник" відноситься до фармацевтично прийнятної (наприклад, безпечної та нетоксичної для ін'єкції людині) розчиняючої речовини, застосовної для приготування відновлюваного складу. Приклади розчинників включають стерильну воду, бактеріостатичну воду для ін'єкцій (БВІ), буферний розчин (наприклад, фосфатно-сольовий буфер), стерильний фізіологічний розчин, розчин Рінгера або розчин декстрози. [0251] Лікарська форма: У даній заявці термін "лікарська форма" і "дозована лікарська форма" відноситься до фізично дискретної одиниці терапевтичного білка для лікування пацієнта. Кожна одиниця містить деяку кількість активної речовини, розраховану для отримання бажаного терапевтичного ефекту. Слід розуміти, однак, що загальна доза в композиції буде визначена лікарем у рамках обґрунтованого медичного висновку. [0252] Замісна ферментна терапія (ЗФТ): У даній заявці термін "замісна ферментна терапія (ЗФТ)” відноситься до будь-якої терапевтичної стратегії, яка коректує дефіцит ферменту з використанням доставки відсутнього ферменту. У деяких варіантах реалізації, відсутній фермент доставляють шляхом інтратекального введення. У деяких варіантах реалізації, відсутній фермент доставляють шляхом інфузії до кров'яного потоку. Після введення фермент поглинається клітинами і транспортується до лізосом, де фермент діє, видаляючи речовини, які накопичуються в лізосомах у результаті ферментної недостатності. Як правило, замісна ферментна терапія лізосомальними ферментами є ефективною, терапевтичні ферменти доставляються до лізосом у клітинах відповідних тканин-мішеней, де проявляється дефект накопичення. [0253] Покращення, збільшення або зменшення: У даній заявці терміни "покращення", "збільшення" або "зменшення" чи граматичні еквіваленти вказують на значення, які співвідносяться зі значеннями базових вимірювань, наприклад, у того ж самого індивіда, до початку обробки/лікування, описаного в даній заявці, або значеннями, виміряними у контрольних індивідів (або декількох контрольних індивідів) при відсутності обробки/лікування, описаного в даній заявці. "Контрольні індивіди" являють собою індивідів, які страждають на ті ж самі форми лізосомної хвороби накопичення, що й індивіди, які проходять лікування, і вони приблизно того ж віку, що й індивіди, які проходять лікування (для того, щоб стадії захворювання індивіда, який проходить лікування, і контрольного індивіда (індивідів) були 20 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 порівнянними). [0254] Індивід, суб'єкт, пацієнт: У даній заявці терміни "індивід", "суб'єкт" або "пацієнт" відносяться до людини або тварини, відмінної від людини. Індивід (який також згадується як "пацієнт" або "суб'єкт"), що проходить лікування, являє собою індивіда (плід, немовля, дитину, підлітка або дорослу людину), що страждає на розглянуте захворювання. [0255] Інтратекальне введення: У даній заявці термін "інтратекальне введення" або "інтратекальна ін'єкція" відноситься до ін'єкції в спинномозковий канал (інтратекальний простір, який оточує спинний мозок). Можуть бути використані різні методики, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: латеральну церебровентрикулярну ін'єкцію через трепанаційний отвір або цистернову чи поперекову пунктуру або т.п. У деяких варіантах реалізації, "інтратекальне введення" або "інтратекальна доставка" відповідно до даного винаходу відноситься до ІТ введення або доставки через поперекову область або відділ, наприклад, поперекове ІТ введення або доставка. У даній заявці термін "поперековий відділ" або "поперекова область" відноситься до області між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш строго, відділу хребта L2-S1. [0256] Лінкер: У даній заявці термін "лінкер" відноситься до амінокислотної послідовності в гібридному білку, крім тієї, яка зустрічається в конкретному положенні в природних білках і, як правило, лінкер сконструйований таким чином, що він є гнучким або являє собою проміжну структуру, таку як а-спіраль, між двома частинами білка. Лінкер також відноситься до спейсера. [0257] Ліопротектор: У даній заявці термін "ліопротектор" відноситься до молекули, яка попереджає або зменшує хімічну і/або фізичну нестабільність білка або іншої речовини при ліофілізації та наступному зберіганні. Приклади ліопротекторів включають цукри, такі як сахароза або трегалоза; амінокислоти, такі як глутамат натрію або гістидин; метиламіни, такі як бетаїн; ліотропні солі, такі як сульфат магнію; багатоатомні спирти, такі як трьохатомні або вищі спирти, наприклад, гліцерин, еритрит, гліцерол, арабітол, ксиліт, сорбіт і манітол, пропіленгліколь, поліетиленгліколь; плюроніки; і їх комбінації. У деяких варіантах реалізації, ліопротектор являє собою невідновлений цукор, такий як трегалоза або сахароза. [0258] Лізосомальний фермент: У даній заявці термін "лізосомальний фермент" відноситься до будь-якого ферменту, який є здатним зменшити накопичені в лізосомах тварин сполуки або який може попередити чи покращити один або більше симптомів лізосомної хвороби накопичення. Лізосомальні ферменти, придатні для даного винаходу, включають як фермент дикого типу, так і модифікований лізосомальний фермент, і вони можуть бути отримані з використанням рекомбінантних і синтетичних методик або можуть бути виділені з природних джерел. Приклади лізосомальних ферментів перераховані в Таблиці 1. [0259] Лізосомна ферментна недостатність: У даній заявці термін "лізосомна ферментна недостатність" відноситься до групи генетичних захворювань, які є результатом недостатності щонайменше одного ферменту, який є необхідним для руйнування макромолекул (наприклад, ферментних субстратів) до пептидів, амінокислот, моноцукрів, нуклеїнових кислот і жирних кислот у лізосомах. У результаті у індивідів, що страждають на лізосомну ферментну недостатність, накопичуються сполуки в різних тканинах (наприклад, ЦНС, печінці, селезінці, кишечнику, стінках кровоносних судин та в інших органах). [0260] Лізосомна хвороба накопичення: У даній заявці термін "лізосомна хвороба накопичення" відноситься до будь-якої хвороби в результаті недостатності одного або декількох лізосомальних ферментів, необхідних для метаболізму природних макромолекул. Ці захворювання, як правило, призводять до накопичення незруйнованих молекул у лізосомах, що призводить до збільшення числа запасних гранул (також називаних запасними пухирцями). Ці захворювання й різні приклади описані більш докладно нижче. [0261] Поліпептид: У даній заявці "поліпептид", у цілому, являє собою ланцюжок із щонайменше 2 амінокислот, з'єднаних одна з одною за допомогою пептидного зв'язку. У деяких варіантах реалізації, поліпептид може включати щонайменше 3-5 амінокислот, кожна з яких з'єднана з іншими з використанням щонайменше одного пептидного зв'язку. Фахівцям у даній області відомо, що поліпептиди можуть включати "неприродні" амінокислоти або інші молекули, які, проте, здатні до інтеграції в поліпептидний ланцюг. [0262] Заміщуючий фермент: У даній заявці термін "заміщуючий фермент" відноситься до будь-якого ферменту, який може діяти як заміщуючий, щонайменше частково, при недостатності або відсутності ферменту при лікуванні хвороби. У деяких варіантах реалізації, термін "заміщуючий фермент" відноситься до будь-якого ферменту, дія якого може заміщувати, щонайменше частково, недостатність або відсутність лізосомальних ферментів при лізосомних хворобах накопичення, що підлягають лікуванню. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент дозволяє знизити накопичення речовин у лізосомах ссавців або може попередити чи 21 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 покращити один або декілька симптомів лізосомної хвороби накопичення. Заміщуючі ферменти, придатні для даного винаходу, включають обидва з ферменту дикого типу і модифікованого лізосомального ферменту та можуть бути отримані з використанням рекомбінантних і синтетичних способів або виділені з природних джерел. Заміщуючий фермент може бути рекомбінантним, синтетичним, ген-активованим або природним ферментом. [0263] Розчинний: У даній заявці термін "розчинний" відноситься до здатності терапевтичного агента утворювати гомогенний розчин. У деяких варіантах реалізації, розчинність терапевтичного агента в розчині, до якого він введений і з використанням якого він транспортується до ділянки-мішені (наприклад, до клітин і тканин головного мозку), є достатньою для доставки терапевтично ефективної кількості терапевтичного агента до сайтумішені. Декілька факторів можуть впливати на розчинність терапевтичних агентів. Наприклад, фактори, які можуть впливати на розчинність білка, включають йонну силу, амінокислотну послідовність і наявність інших супутніх косолюбілізуючих агентів або солей (наприклад, солей кальцію). У деяких варіантах реалізації, фармацевтичні композиції складені так, що солі кальцію виключаються з таких композицій. У деяких варіантах реалізації, терапевтичні агенти відповідно до даного винаходу є розчинними у відповідній фармацевтичній композиції. Слід мати на увазі, що хоча ізотонічні розчини, як правило, є переважними для парентерального введення складів, застосування ізотонічних розчинів може обмежувати адекватну розчинність для деяких терапевтичних агентів і, зокрема, деяких білків і/або ферментів. Було продемонстровано, що злегка гіпертонічні розчини (наприклад, до 175 мМ хлориду натрію в 5 мМ фосфату натрію при рН 7,0) і цукровмісні розчини (наприклад, до 2 % сахарози в 5 мМ фосфату натрію при рН 7,0) добре переносяться мавпами. Наприклад, найпоширенішою прийнятою композицією болюсного складу для ЦНС є фізіологічний розчин (150 мМ NaCl у воді). [0264] Стабільність: У даній заявці термін "стабільність" відноситься до здатності терапевтичного агента (наприклад, рекомбінантного ферменту) підтримувати його терапевтичну ефективність (наприклад, усю або переважно всю його передбачувану біологічну активність і/або фізико-хімічну цілісність) при тривалому періоді часу. Стабільність терапевтичного агента і здатність фармацевтичної композиції підтримувати стабільність такого терапевтичного агента можуть бути оцінені протягом тривалого періоду часу (наприклад, щонайменше протягом 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 місяців і більше). Загалом, фармацевтичні композиції згідно з даним винаходом були створені таким чином, щоб вони були здатні стабілізувати або ж сповільнювати чи запобігати деградації одного або більше терапевтичних агентів, поєднаних із ними (наприклад, рекомбінантних білків). У контексті даного винаходу стабільним складом є той, у якому терапевтичний агент по суті зберігає свої фізичну і/або хімічну цілісність і біологічну активність при зберіганні й під час обробки (наприклад, заморожування/відтавання, механічного перемішування й ліофілізації). Стабільність білка може бути оцінена за утворенням високомолекулярних агрегатів, втратою ферментативної активності, формуванням пептидних фрагментів і зміщенням профілів заряду. [0265] Суб'єкт: У даній заявці термін "суб'єкт" означає будь-якого ссавця, включаючи людину. У деяких варіантах реалізації даного винаходу суб'єкт являє собою дорослого, підлітка і немовля. Крім того, даний винахід передбачає введення фармацевтичної композиції і/або здійснення способів лікування внутрішньоутробно. [0266] Суттєва гомологія: У даній заявці словосполучення "суттєва гомологія" відноситься до порівняння між послідовностями амінокислот або нуклеїнових кислот. Як буде зрозуміло фахівцям у даній області, дві послідовності зазвичай вважаються "по суті гомологічними", якщо вони містять гомологічні залишки у відповідних положеннях. Гомологічні залишки можуть бути однаковими залишками. Крім того, гомологічні залишки можуть бути неідентичними залишками, які мають адекватно близькі структурні і/або функціональні характеристики. Наприклад, як добре відомо фахівцям у даній області, деякі амінокислоти зазвичай класифікують як "гідрофобні" або "гідрофільні" амінокислоти і/або такі, що мають "полярні" або "неполярні" бічні ланцюги. Заміна однієї амінокислоти на іншу того ж типу часто може вважатися "гомологічною" заміною. [0267] Як добре відомо в даній області, амінокислотні послідовності або послідовності нуклеїнових кислот можуть бути порівняні з використанням будь-якого з множини алгоритмів, у тому числі тих, які доступні серед комерційних комп'ютерних програм, таких як BLASTN для нуклеотидних послідовностей і BLASTP, gapped BLAST і PSI-BLAST для амінокислотних послідовностей. Приклади таких програм описані в Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of 22 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. На додаток до ідентифікації гомологічних послідовностей, програми, згадані вище, як правило, забезпечують індикацію ступеня гомології. У деяких варіантах реалізації, дві послідовності вважаються дійсно гомологічними, якщо щонайменше 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше їхніх відповідних залишків є гомологічними до відповідної ділянки залишків. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка залишків є повною послідовністю. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка складає щонайменше 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 або більше залишків. [0268] Суттєва ідентичність: У даній заявці словосполучення "суттєва ідентичність" відноситься до порівняння послідовностей амінокислот або нуклеїнових кислот. Як буде зрозуміло фахівцям у даній області, дві послідовності, як правило, вважаються "по суті ідентичними", якщо вони містять однакові залишки у відповідних позиціях. Як добре відомо в даній області, амінокислотні послідовності або послідовності нуклеїнових кислот можуть бути порівняні з використанням будь-якого з множини алгоритмів, у тому числі тих, які доступні серед комерційних комп'ютерних програм, таких як BLASTN для нуклеотидних послідовностей і BLASTP, gapped BLAST і PSI-BLAST для амінокислотних послідовностей. Приклади таких програм описані в Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. На додаток до визначення однакових послідовностей, програми, згадані вище, як правило, забезпечують індикацію ступеня ідентичності. У деяких варіантах реалізації, дві послідовності вважаються дійсно ідентичними, якщо не менше 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % або більше їхніх відповідних залишків ідентичні до відповідної ділянки залишків. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка є повною послідовністю. У деяких варіантах реалізації, відповідна ділянка складає щонайменше 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 або більше залишків. [0269] Синтетична СМР: У даній заявці термін "синтетична СМР" відноситься до розчину, який має рН, електролітний склад, вміст глюкози і осмос, що відповідають таким характеристикам у спинномозковій рідині. Синтетичну СМР також називають штучною СМР. У деяких варіантах реалізації, синтетична СМР являє собою розчин Елліотта B. [0270] Підходящий для доставки до ЦНС: У даній заявці фраза "підходящий для доставки до ЦНС" або "підходящий для інтратекальної доставки" стосовно фармацевтичної композиції згідно з даним винаходом, як правило, відноситься до стабільності, переносимості та властивостей розчинності таких композицій, а також до здатності таких композицій доставляти ефективну кількість терапевтичного агента, що міститься в ньому, до цільових місць доставки (наприклад, до СМР або мозку). [0271] Тканини-мішені: У даній заявці термін "тканини-мішені" відноситься до будь-якої тканини, на яку впливає лізосомна хвороба накопичення, яка розглядається для лікування, або будь-якої тканини, в якій недостатньо лізосомальних ферментів, виражених у нормі. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають ті тканини, в яких існує помітна або аномально висока кількість ферменту, субстрату, наприклад, накопичених у клітинних лізосомах тканини, у пацієнтів, що страждають на або мають сприйнятливість до лізосомної хвороби накопичення. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають ті тканини, які відображають патології, супутні хвороби, симптоми або функції. У деяких варіантах реалізації, тканини-мішені включають тканини, в яких недостатньо лізосомальних ферментів, як правило, в нормі експресованих на високому рівні. У даній заявці "тканини-мішені" можуть являти собою тканинимішені головного мозку, тканини-мішені спинного мозку і/або периферичні тканини-мішені. Приклади тканин-мішеней докладно описані нижче. [0272] Терапевтична група/фрагмент: У даній заявці термін "терапевтична група/фрагмент" відноситься до групи/фрагменту молекули, яка обумовлює терапевтичний ефект молекули. У деяких варіантах реалізації, терапевтична група/фрагмент являє собою поліпептид, що має терапевтичну активність. [0273] Терапевтично ефективна кількість: У даній заявці термін "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості терапевтичного білка (наприклад, заміщуючого ферменту), який дає терапевтичний ефект у суб'єкта, що пройшов лікування, відповідно до розумного 23 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 співвідношення користь/ризик, застосовного для будь-якого медичного лікування. Терапевтичний ефект може бути об'єктивним (тобто вимірюваним із використанням деяких випробувань чи маркерів) або суб'єктивним (тобто суб'єкт проявляє ознаки або відчуває ефект). Зокрема, "терапевтично ефективна кількість" відноситься до кількості терапевтичного білка або композиції, яка забезпечує лікування, покращення або попередження бажаного захворювання чи стану або демонструє помітний терапевтичний чи профілактичний ефект, такий як покращення симптомів, пов'язаних із хворобою, попередження або затримка прояву захворювання і/або зменшення тяжкості або частоти симптомів захворювання. Терапевтично ефективну кількість зазвичай вводять у режимі введення, який може включати багаторазове введення доз. Для будь-якого конкретного терапевтичного білка, терапевтично ефективна кількість (і/або відповідна доза з ефективним режимом введення) може варіювати, наприклад, у залежності від способу введення, в комбінації з іншими фармацевтичними засобами. Крім того, конкретна терапевтично ефективна кількість (і/або доза) для кожного конкретного пацієнта може залежати від різних факторів, включаючи захворювання, яке лікують, тяжкість захворювання; активність застосовуваного конкретного фармацевтичного агента, конкретного застосовуваного складу; вік, масу тіла, загальний стан здоров'я, стать і дієту пацієнта, час введення, шлях введення і/або швидкість виведення або метаболізму застосовуваного конкретного гібридного білка, тривалість лікування і подібні фактори, які добре відомі в медицині. [0274] Допустимий/переносимий: У даній заявці терміни "допустимий/переносимий" і "переносимість" відносяться до здатності фармацевтичних композицій згідно з даним винаходом не викликати побічних реакцій у суб'єкта, якому вводять таку композицію, або, як варіант, не викликати серйозної побічної реакції у суб'єкта, якому вводять таку композицію. У деяких варіантах реалізації, фармацевтична композиція згідно з даним винаходом добре переноситься суб'єктом, якому вводять таку композицію. [0275] Лікування: У даній заявці термін "лікування" (а також "лікувати/обробляти") відноситься до будь-якого введення терапевтичного білка (наприклад, лізосомального ферменту), яке повністю або частково пом'якшує, покращує стан, знімає, гальмує, затримує настання, зменшує тяжкість і/або зменшує частоту одного чи декількох симптомів або особливостей конкретного захворювання, розладу і/або умови (наприклад, синдрому Хантера, синдрому Санфіліппо типу B). Таке лікування/обробка може проводитися для суб'єкта, який не проявляє ознак відповідного захворювання, розладу і/або стану, і/або суб'єкта, який демонструє тільки перші ознаки захворювання, розладу і/або патологічного стану. Як альтернатива або доповнення таке лікування може проводитися для суб'єкта, який має одну або більше виражених ознак відповідного захворювання, розладу і/або патологічного стану. Докладний опис [0276] Даний винахід передбачає, серед іншого, покращені способи для ефективної прямої доставки терапевтичних агентів до центральної нервової системи (ЦНС). Як уже обговорювалося вище, даний винахід оснований на несподівано виявленому факті, що заміщуючий фермент для лізосомної хвороби накопичення може бути безпосередньо введений до спинномозкової рідини (ліквору) суб'єкта, що потребує лікування, у високих концентраціях, не викликаючи суттєвих несприятливих ефектів у суб'єкта. Найбільш дивно, автори даного винаходу виявили, що заміщуючий фермент може бути доставлений у простому фізіологічному розчині або буферній композиції без застосування синтетичної СМР. Ще більш несподіваним є те, що інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу не призводить до суттєвих побічних ефектів, таких як тяжка імунна відповідь, у суб'єкта. Таким чином, у деяких варіантах реалізації інтратекальну доставку відповідно до даного винаходу можна застосовувати при відсутності супутньої імунопригнічуючої терапії (наприклад, без індукції імунної толерантності з використанням попередньої обробки або попередньої підготовки). [0277] У деяких варіантах реалізації, інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу забезпечує ефективну дифузію до різних тканин головного мозку, що призводить до ефективного заміщення ферменту в різних тканинах-мішенях на поверхні головного мозку, до неглибоких і/або глибоких областей головного мозку. У деяких варіантах реалізації інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу забезпечує достатню кількість заміщуючого ферменту, який циркулює в периферичній системі кровообігу. У результаті в деяких випадках інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу призводить до доставки заміщуючого ферменту до периферичних тканин, таких як печінка, серце й нирки. Цей результат є несподіваним і може бути особливо корисним для лікування лізосомних хвороб накопичення, що зачіпають як ЦНС, так і периферичні компоненти, які, як правило, потребують як регулярного інтратекального введення, так і внутрішньовенного введення. Припускається, що інтратекальна доставка відповідно до даного винаходу може дозволити зменшити дози і/або 24 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 частоту внутрішньовенної ін'єкції без шкоди для терапевтичного ефекту при лікуванні периферичних симптомів. [0278] Даний винахід забезпечує різні несподівані й корисні ознаки, які забезпечують ефективну та зручну доставку заміщуючого ферменту до різних тканин мозку, що призводить до ефективного лікування лізосомних хвороб накопичення, прояв яких пов'язаний із ЦНС. [0279] Різні аспекти даного винаходу докладно описані в наступних розділах. Використання розділів не призначене для обмеження даного винаходу. Кожний розділ можна застосувати до будь-якого аспекту даного винаходу. У даній заявці використання "або" означає "і/або", якщо не зазначено інше. Лізосомні хвороби накопичення і заміщуючі ферменти [0280] Способи згідно з даним винаходом можна застосовувати для лікування будь-яких лізосомних хвороб накопичення, зокрема лізосомних хвороб накопичення, що мають етіологію і/або симптоми ЦНС, включаючи, але не обмежуючись перерахованими: аспартилглюкозамінурію, хворобу накопичення холестеринових ефірів, хворобу Вольмана, цистиноз, хворобу Данона, хворобу Фабрі, ліпогрунуломатоз Фарбера, хворобу Фарбера, фукозидоз, галактазидоз I/II типів, хворобу Гоше I/II/III типу, лейкодистрофію глобоїдних клітин, хворобу Краббе, хворобу накопичення глікогену II, хворобу Помпі, GM1-гангліозидоз I/II/III типу, GM2-гангліозидоз I типу, хворобу Тея-Сакса, GM2-гангліозидоз II типу, хворобу Сандхофа, GM2гангліозидоз, α-манозидоз I/II типу, β-манозидоз, метахроматичну лейкодистрофію, муколіпідоз типу I, сіалідоз типу I/II, муколіпідоз II/III типу, хворобу клітинних включень, муколіпідоз типу IIIC, муколіпідоз III типу, мукополісахаридоз I типу, мукополісахаридоз II типу, синдром Хантера, мукополісахаридоз IIIA типу, синдром Санфіліппо (тип A, B, C або D), мукополісахаридоз IIIB типу, мукополісахаридоз IIIC типу, мукополісахаридоз IIID типу, мукополісахаридоз IVA типу, синдром Моркіо, мукополісахаридоз IVB типу, мукополісахаридоз VI типу, мукополісахаридоз VII типу, синдром Слая, мукополісахаридоз IX типу, множинний дефіцит сульфатази, нейронний цероїдний ліпофусциноз, хворобу Баттена CLN1, хворобу Баттена CLN2, хворобу Німана-Піка типу A/B, хворобу Німана-Піка типу C1, хворобу Німана-Піка типу C2, пікнодизостоз, хворобу Шиндлера I/II типу, хворобу Гоше і хворобу накопичення сіалових кислот. [0281] У деяких варіантах реалізації, лізосомні хвороби накопичення, які можна лікувати способами згідно з даним винаходом, включають синдром Хантера, метахроматичну лейкодистрофію (МЛД), синдром Санфіліппо типу А, синдром Санфіліппо типу В і лейкодистрофію глобоїдних клітин (ЛГК). [0282] Докладний огляд генетичної етіології, клінічних проявів і молекулярно-біологічних механізмів лізосомних хвороб накопичення докладно викладений у роботі Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7.sup.th Ed., Vol. II, Mcgraw Hill, (1995). Таким чином, ферментна недостатність при вищезгаданих захворюваннях відома фахівцям у даній області, деякі з таких захворювань наведені як приклади в таблиці нижче: Таблиця 1 Назва хвороби Хвороба Помпа Недостатність ферменту Кисла α1,4-глюкорозилаза GM1 гангліозидоз Хвороба Тея-Сакса GM2 гангліозидоз: AB варіант Хвороба Сандхофа Хвороба Фабрі Хвороба Гоше Метахроматична лейкодистрофія Хвороба Краббе Хвороба Німана-Піка, типи AіB Хвороба Німана-Піка, тип C β-галактозидаза β-гексозамінідаза A GM2 активаторний білок Речовини, що накопичуються Глікоген α1,4-зв'язані олігосахариди GM1 гангліозид GM2 гангліозид GM2 гангліозид β-гексозамінідаза A і B α-галактозидаза A глюкоцереброзидаза Арилсульфатаза A GM2 гангліозид глобозиди глюкосилцерамід Сульфатиди Галактозилцерамідаза Кисла сфінгомієліназа Галактоцереброзид Сфінгомієлін Пошкодження естерифікації холестерину Невідомо Кисла керамідаза Кисла ліпаза Сфінгомієлін Хвороба Німана-Піка, тип D Хвороба Фарбера Хвороба Вольмана 25 Сфінгомієлін Церамід Холестеринові ефіри UA 115648 C2 Продовження таблиці 1 Синдром Хурлера (MPS IH) Синдром Шая (MPS IS) Хурлер-Шай (MPS IH/S) Синдром Хантера (MPS II) Синдром Санфіліппо типу A (MPS IIIA) Синдром Санфіліппо типу B (MPS IIIB) Синдром Санфіліппо типу C (MPS IIIC) Синдром Санфіліппо типу D (MPS IIID) Моркіо B (MPS IVB) Марото-Ламі (MPS VI) Синдром Слая (MPS VII) α-манозидоз β-манозидоз Фукозидоз Аспартилглюкозамінурія Сіалідоз (Муколіпідоз I) Галактосіалідоз (синдром Голдберга) Хвороба Шиндлера Муколіпідоз II (I-клітинна хвороба) Муколіпідоз III (псевдоХантер полідистрофія) Цистиноз Хвороба Салла Інфантильна хвороба накопичення сіалових кислот Інфантильний нейроцероїдний ліпофусциноз Муколіпідоз IV Просапозин 5 10 15 α-l-ідуронідаза α-l-ідуронідаза α-l-ідуронідаза Ідуронат сульфатаза Гепаран N-сульфатаза Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран і дерматан, сульфати Гепаран сульфатаза α-N-ацетилглюкозамінідаза Гепаран сульфатаза Ацетил-CoA-глюкозамімінід ацетилтрансфераза Ацетилглюкозамін-6сульфатаза β-галактозидаза Арилсульфатаза B β-глюкоронідаза α-манозидаза β-манозидаза α-L-фукозидаза N-аспартил-βглюкозоамінідаза α -нейромінідаза Недостатність лізосомного захисного білка α-N-ацетилгалактозамінідаза N-ацетилглюкозоамін-1фосфотрансфераза Те ж, що й при ML II Гепаран сульфатаза Цистин транспортний білок Сіаловий кислий транспортний білок Сіаловий кислий транспортний білок Вільний цистин Вільна сіалова кислота і глюкуронова кислота Вільна сіалова кислота і глюкуронова кислота Пальмітоїл-білкова тіоестераза Невідомо Ліпофусцини Гепаран сульфатаза Кератан сульфат Дерматан сульфат Маноза/олігосахариди Маноза/олігосахариди Фукозил олігосахариди Аспартилглюкозамін аспарагіни Сіалілолігосахариди Сіалілолігосахариди Гепаран сульфат Гангліозиди & гіалуронові кислоти Сапозини A, B, C і D Заміщуючі ферменти [0283] Способи згідно з даним винаходом можна застосовувати для доставки будь-яких заміщуючих ферментів. У даній заявці заміщуючі ферменти, підходящі для даного винаходу, можуть включати будь-який фермент, який може діяти як такий, що заміщує, щонайменше частково, активність недостатнього або відсутнього лізосомального ферменту при лізосомній хворобі накопичення, яка підлягає лікуванню. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент здатний знизити накопичені речовини в лізосомах, або він може полегшити чи покращити один або декілька симптомів лізосомної хвороби накопичення. [0284] У деяких варіантах реалізації, підходящі заміщуючі ферменти можуть являти собою будь-які лізосомальні ферменти, про які відомо, що вони пов'язані з лізосомною хворобою накопичення, яку лікують. У деяких варіантах реалізації, підходящі заміщуючі ферменти обрані з ферментів, перерахованих у таблиці 1. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, являє собою ідуронат-2-сульфатазу (I2S), арилсульфатазу (ASA), гепаран-N-сульфатазу (HNS), альфа-N-ацетилглюкозамінідазу (Naglu) або βгалактозидазу (GLC). 26 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 [0285] У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може мати послідовність дикого типу або природну послідовність. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може мати змінену послідовність, по суті ідентичну або гомологічну послідовності дикого типу або природній послідовності (наприклад, таку, що має щонайменше 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ідентичності послідовності з послідовністю дикого типу або природною послідовністю). [0286] Заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може бути отриманий будьяким доступним способом. Наприклад, заміщуючі ферменти можуть бути отримані рекомбінантним шляхом з використанням системи клітини-хазяїна, в якій експресуються нуклеїнові кислоти, які кодують заміщуючий фермент. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти можуть бути отримані шляхом активації ендогенних генів. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти можуть бути частково або повністю отримані шляхом хімічного синтезу. Як альтернатива або доповнення, заміщуючі ферменти також можуть бути виділені з природних джерел. [0287] При отриманні ферментів рекомбінантним шляхом можна застосовувати будь-яку систему експресії. Наприклад, відомі системи експресії включають, наприклад, яйцеклітини, бакуловіруси, рослини, дріжджі або клітини ссавців. [0288] У деяких варіантах реалізації, ферменти, підходящі для даного винаходу, отримують у клітинах ссавців. Необмежуючі приклади клітин ссавців, які можна застосовувати відповідно до даного винаходу, включають лінію мишачої мієломи BALB/с (NSO/I, ECACC No: 85110503); ретинобласти людини (PER.C6, Crucell, Лейден, Нідерланди); лінію CV1 нирок мавпи, трансформовану SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); лінію клітин нирки ембріона людини (293 або 293 клітини, субклоновані для росту в суспензійній культурі, Graham et al., J. Gen Virol, 36:59,1977.); клітинну лінію фібросаркоми людини (наприклад, HT1080); клітини нирок дитинчат хом'яка (BHK, ATCC CCL 10); клітини яєчника китайського хом'ячка +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); клітини Сертолі миші (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); клітини нирки мавпи (CV1 ATCC CCL 70); клітини нирки африканської зеленої мавпи (VERO-76, ATCC CRL-1 587); клітини цервікальної карциноми людини (Hela, ATCC CCL 2); клітини нирки собаки (MDCK, ATCC CCL 34); клітини печінки пацюків buffalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); клітини легені людини (W138, ATCC CCL 75); клітини печінки людини (Hep G2, HB 8065); клітини пухлини молочної залози миші (MMT 060562, ATCC CCL51); клітини TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 клітини; клітини FS4 і лінія гепатоми людини (Hep G2). [0289] У деяких варіантах реалізації, запропоновані способи відповідно до даного винаходу застосовують для доставки заміщуючи ферментів, які виробляються клітинами людини. У деяких варіантах реалізації, способи, які пропонуються, відповідно до даного винаходу застосовують для доставки заміщуючих ферментів, які виробляються клітинами СНО. [0290] У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти, які доставляються з використанням способу згідно з даним винаходом, містять молекулу, яка зв'язується з рецепторами на поверхні клітин головного мозку, що сприяє поглинанню клітинами і/або націлюванню на лізосоми. Наприклад, такий рецептор може являти собою катіон-незалежний маноза-6-фосфат рецептор (CI-MPR), який зв'язується з залишком маноза-6-фосфату (M6P). Крім того, CI-MPR також зв'язується з іншими білками, у тому числі IGF-II. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, містить залишки M6P на поверхні білка. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент, підходящий для даного винаходу, може містити біс-фосфорильовані олігосахариди, які мають більш високу афінність зв'язування з CI-MPR. У деяких варіантах реалізації, підходящий фермент містить щонайменше приблизно 20 %-біс-фосфорильованих олігосахаридів у ферменті. У інших варіантах реалізації, підходящі ферменти можуть містити приблизно 10 %, 15 %, 18 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % біс-фосфорильованих олігосахаридів у ферменті. Хоча такі бісфосфорильовані олігосахариди можуть природно бути присутніми в ферменті, слід зазначити, що ферменти можуть бути модифіковані з отриманням ферментів, які містять такі олігосахариди. Наприклад, підходящі заміщуючі ферменти можуть бути модифіковані з використанням деяких ферментів, які здатні каталізувати перенос N-ацетилглюкозаміна-Lфосфату з UDP-GlcNAc в положенні 6'α-1,2-зв'язаних маноз на лізосомальні ферменти. Способи і композиції для отримання і застосування таких ферментів описані, наприклад, Canfield et al. у патенті США № 6537785 і патенті США № 6534300, кожний із яких включений до даної заявки за допомогою посилання. [0291] У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти для застосування в даному винаході можуть бути кон'юговані або гібридизовані з молекулами, що обумовлюють 27 UA 115648 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 спрямовану доставку (таргетинг) до лізосом, які здатні зв'язуватися з рецептором на поверхні клітин головного мозку. Підходящими молекулами для лізосомного таргетингу є IGF-I, IGF-II, RAP, p97 і їх варіанти, гомологи або фрагменти (наприклад, включаючи їх пептиди, що мають послідовність, щонайменше на 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % або 95 % ідентичну послідовності зрілого пептиду людини IGF-I, IGF-II, RAP, p97 дикого типу). [0292] У деяких варіантах реалізації, заміщуючі ферменти, придатні для даного винаходу, не модифіковані для покращення доставки або транспорту таких агентів через ГЕБ і до ЦНС. Інтратекальна доставка [0293] Відповідно до даного винаходу заміщуючий фермент доставляють до ЦНС. У деяких варіантах реалізації, заміщуючий фермент доставляють до центральної нервової системи шляхом введення до спинномозкової рідини (ліквору) суб'єктові, що потребує такого лікування. У деяких варіантах реалізації, для доставки бажаного заміщуючого ферменту до СМР застосовують інтратекальне введення. У даній заявці інтратекальне введення (також відоме як інтратекальна ін'єкція) відноситься до ін'єкції до спинномозкового каналу (інтратекальний простір, який оточує спинний мозок). Можуть застосовуватися різні методики, включаючи, без обмежень, церебровентрикулярні ін'єкції через трепанаційний отвір або цистерни, або спинномозкову пункцію, або тому подібне. Приклади способів описані в роботах Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 і Omaya et al., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179, зміст яких включений до даної заявки за допомогою посилання. [0294] Відповідно до даного винаходу фермент може бути ін'єктований у будь-яку область навколо спинномозкового каналу. У деяких варіантах реалізації, фермент ін'єктують у поперекову область або цистерну, або інтравентрикулярно в простір мозкового шлуночка. У даній заявці термін "поперековий відділ" або "поперекова область" відноситься до області між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш строго, до відділу хребта L2-S1. Як правило, інтратекальні ін'єкції через поперековий відділ або поперекову область також називають "поперековою ІТ доставкою" або "поперековим ІТ введенням". Термін "цистерна" відноситься до простору навколо й нижче мозочка через отвір між черепом і у верхній частині хребта. Як правило, інтратекальне введення через цистерну також згадується як "доставка до великої цистерни". Термін "шлуночок мозку" відноситься до порожнини мозку, яка продовжується в центральному каналі спинного мозку. Як правило, ін'єкції через мозкову порожнину шлуночка називають інтравентрикулярною церебральною (ІЦВ) доставкою. [0295] У деяких варіантах реалізації, "інтратекальне введення" або "інтратекальна доставка" відповідно до даного винаходу відноситься до поперекового ІТ введення або доставки, наприклад, доставки між третім і четвертим поперековими (нижня частина спини) хребцями й, більш конкретно, до L2-S1 відділу хребта. Припускається, що поперекове ІТ введення або доставка відрізняється від доставки до великої цистерни тим, що поперекове ІТ введення або доставка відповідно до даного винаходу забезпечує кращу й більш ефективну доставку до дистального каналу хребта, у той час як цистернова доставка, крім усього іншого, як правило, не забезпечує доставку складу до дистального каналу хребта. Стабільні склади для ІТ доставки [0296] У деяких варіантах реалізації, бажані ферменти додають до стабільних складів для інтратекальної доставки. Деякі варіанти реалізації даного винаходу основані, щонайменше частково, на виявленому факті, що різні композиції, описані в даній заявці, сприяють ефективній доставці й розподілу одного або більше терапевтичних агентів (наприклад, ферменту) у тканинах-мішенях, у цільових клітинах і/або органелах ЦНС. Серед іншого, композиції, описані в даній заявці, здатні солюбілізувати високі концентрації терапевтичних агентів (наприклад, білків або ферментів) і придатні для доставки таких терапевтичних агентів до ЦНС суб'єктів при лікуванні захворювань, що мають пов'язаний із ЦНС компонент і/або етіологію. Композиції, описані тут, також характеризуються покращеною стабільністю й покращеною переносимістю при введенні до ЦНС суб'єкта (наприклад, інтратекально), що цього потребує. [0297] До даного винаходу для інтратекальної доставки зазвичай застосовували традиційний небуферний ізотонічний сольовий розчин і розчин Елліотта В, який являє собою штучну СМР. Порівняння складу СМР і розчину Елліотта В наведене в Таблиці 2. Як показано в Таблиці 2, концентрації речовин у розчині Елліотта В близькі таким концентраціям у СМР. Розчин Елліотта В, однак, містить дуже низькі концентрації буфера і, відповідно, не може забезпечити адекватну буферну ємність, необхідну для стабілізації терапевтичних агентів (наприклад, білків), особливо протягом тривалого періоду часу (наприклад, у ході зберігання). Крім того, розчин Елліотта В містить деякі солі, які можуть бути несумісними зі складами, призначеними для доставки деяких терапевтичних агентів і, зокрема, білків або ферментів. 28
ДивитисяДодаткова інформація
Назва патенту англійськоюCns delivery of therapeutic agents
Автори англійськоюCalias, Pericles, Pan, Jing, Powell, Jan, Charnas, Lawrence, McCauley, Thomas, Wright, Teresa Leah, Pfeifer, Richard, Shahrokh, Zahra
Автори російськоюКалиас Перикл, Пен Джинг, Поуелл Джан, Чарнас Лоренс, МакКоли Томас, Райт Тереза Лиа, Пфейфер Ричард, Шарок Зара
МПК / Мітки
МПК: A61K 38/46
Мітки: доставка, терапевтичних, агентів, цнс
Код посилання
<a href="https://ua.patents.su/277-115648-dostavka-terapevtichnikh-agentiv-do-cns.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Доставка терапевтичних агентів до цнс</a>
Попередній патент: Застосування аналога тестостерону і агоніста 5-нт1а для лікування сексуальної дисфункції
Наступний патент: Способи та композиції для доставки до цнс ідуронат-2-сульфатази
Випадковий патент: Спосіб вирощування цукрової кукурудзи на темно-каштановому ґрунті при зрошенні