Спосіб одержання 7-амінодеацетилцефалоспоранової кислоти, спосіб одержання 7-аміноцефалоспоранової кислоти, вектор експресії рекомбінантної днк (варіанти), клітина-хазяїн penicillium chrysogenum (варіанти), спо

1 Способ получения 7аминодеацетилцефалоспорановой кислоты (7АДАЦ), отличающийся тем, что осуществляют - выращивание штамма Penicilhum chrysogenum, который образует изопенициллин N, в культуральной среде, способной поддерживать его рост, и добавление к упомянутой культуральной среде источника поступления адипата, выбранного из группы адипиновая кислота и/или ее соли и эфиры, при этом источник поступления адипата усваивается и используется упомянутым штаммом Penicilhum chrysogenum для образования адипоил6-аминопенициллановой кислоты (адипоил-6АПК), посредством чего и образуется упомянутая адипоил-6-АПК, - осуществление следующих ферментативных превращений посредством экспрессии in situ соответствующих генов - кольцо адипоил-6-АПК расширяется in situ с об разованием адипоил-7аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АДЦК), ферментом экспандазой, где упомянутый штамм Penicilhum chrysogenum был трансформирован ДНК, кодирующей активность экспандазного фермента, который способен воспринимать упомянутую адипоил-6-АПК в качестве субстрата, где в результате экспрессии этой ДНК кольцо упомянутой адипоил-6-АПК, образуемой упомянутым штаммом, расширяется in situ с образованием адипоил-7-АДЦК, - 3-метильная боковая группа адипоил-7-АДЦК гидроксилируется in situ с образованием адипоил7-аминодеацетилцефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АДАЦ) ферментом гидроксилазой, где упомянутый штамм Penicilhum chrysogenum был трансформирован ДНК, кодирующей активность гидроксилазного фермента, который способен воспринимать упомянутую адипоил-7-АДЦК в качестве субстрата, где после трансформации, в результате экспрессии этой ДНК упомянутая адипоил-7-АДЦК, образуемая упомянутым штаммом, гидроксилируется in situ с образованием адипоил7-АДАЦ, и - взаимодействие упомянутой адипоил-7-АДАЦ с адипоил-амидазой, посредством чего боковая цепь адипоила удаляется и образуется продукт 7АДАЦ, и упомянутый продукт затем выделяется 2 Способ по п 1, отличающийся тем, что источником поступления адипата является динатрий адипат 3 Способ по п 1, отличающийся тем, что ДНК, кодирующая активность экспандазного и гидроксилазного ферментов, происходит из Cephalosponum acremomum 4 Способ по п 3, отличающийся тем, что используют один бифункциональный фермент экспандаза/гидроксилаза 5 Способ по п 1, отличающийся тем, что адипоил-амидаза происходит из видов Pseudomonas 6 Способ получения 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК), отличающийся тем, что осуществляют - выращивание штамма Penicilhum chrysogenum, который образует изопенициллин N, в культу О ю 00 го 47385 ральной среде, способной поддерживать его рост, и добавление к упомянутой культуральной среде источника поступления адипата, выбранного из группы адипиновая кислота и/или ее соли и эфиры, при этом источник поступления адипата усваивается и используется упомянутым штаммом Penicilhum chrysogenum для образования адипоил6-аминопенициллановой кислоты (адипоил-6АПК), посредством чего и образуется упомянутая адипоил-6-АПК, - осуществление следующих ферментативных превращений посредством экспрессии in situ соответствующих генов - кольцо адипоил-6-АПК расширяется in situ с образованием адипоил-7аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АДЦК) ферментом экспандазой, где упомянутый штамм Penicilhum chrysogenum был трансформирован ДНК, кодирующей активность экспандазного фермента, который способен воспринимать упомянутую адипоил-6-АПК в качестве субстрата, где в результате экспрессии этой ДНК кольцо упомянутой адипоил-6-АПК, образуемой упомянутым штаммом, расширяется in situ с образованием адипоил-7-АДЦК, - 3-метильная боковая группа адипоил-7-АДЦК гидроксилируется in situ с образованием адипоил7-аминодеацетилцефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АДАЦ) ферментом гидроксилазой, где упомянутый штамм Penicilhum chrysogenum был трансформирован ДНК, кодирующей активность гидроксилазного фермента, который способен воспринимать упомянутую адипоил-7-АДЦК в качестве субстрата, где после трансформации в результате экспрессии этой ДНК упомянутая адипоил-7-АДЦК, образуемая упомянутым штаммом, гидроксилируется in situ с образованием адипоил7-АДАЦ, и адипоил-7-АДАЦ ацилируется in situ с образованием адипоил-7-аминоцефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АЦК) ферментом ацетилтрансферазой, где упомянутый штамм Penicilhum chrysogenum был трансформирован ДНК, кодирующей активность ацетилтрансферазного фермента, который способен воспринимать упомянутую адипоил-7-АДАЦ в качестве субстрата, после трансформации в результате экспрессии этой ДНК упомянутая адипоил-7-АДАЦ, образуемая упомянутым штаммом, ацилируется in situ с образованием адипоил-7-АЦК, - взаимодействие упомянутой адипоил-7-АЦК с адипоил-амидазой, посредством чего боковая цепь адипоила удаляется и образуется продукт 7АЦК, и упомянутый продукт затем выделяется 7 Способ по п 6, отличающийся тем, что источником поступления адипата является динатрий адипат 8 Способ по п 6, отличающийся тем, что ДНК, кодирующая активность экспандазного, гидроксилазного и ацетилтрансферазного ферментов, происходит из Cephalosponum acremonium 9 Способ по п 8, отличающийся тем, что используется один бифункциональный фермент экспандаза/гидроксилаза 10 Способ по п 6, отличающийся тем, что адипоил-амидаза происходит из видов Pseudomonas 11 Вектор экспрессии рекомбинантной ДНК, плазмида pPEN/CEPH-1, который способен встраиваться в хромосомную ДНК рекомбинантного штамма Penicilhum chrysogenum, где указанный вектор состоит по существу из ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную активность, происходящую из Cephalosponum acremonium, и промотора, который управляет экспрессией ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную активность, причем указанный промотор состоит по существу из промотора гена IPNS Penicilhum chrysogenum 12 Вектор экспрессии рекомбинантной ДНК, плазмида рРепСАСТ, который способен встраиваться в хромосомную ДНК рекомбинантного штамма Penicilhum chrysogenum, где указанный вектор состоит по существу из ДНК, кодирующей ацетилтрансферазную активность, происходящую из Cephalosponum acremonium, и промотора, который управляет экспрессией ДНК, кодирующей ацетилтрансферазную активность, причем указанный промотор состоит по существу из промотора гена IPNS Penicilhum chrysogenum 13 Вектор экспрессии рекомбинантной ДНК, плазмида pTS-8, который способен встраиваться в хромосомную ДНК рекомбинантного штамма Penicilhum chrysogenum, где указанный вектор состоит по существу из ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, происходящую из Cephalosponum acremonium, и промотора, который управляет экспрессией ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, причем указанный промотор состоит по существу из промотора гена IPNS Penicilhum chrysogenum 14 Клетка-хозяин Penicilhum chrysogenum ATCC 74186, трансформированная вектором экспрессии рекомбинантной ДНК, плазмидой pPEN/CEPH-1, который способен встраиваться в хромосомную ДНК указанной клетки-хозяина, где указанная плазмида состоит по существу из ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную активность, происходящую из Cephalosponum acremonium, и промотора, который управляет экспрессией ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную активность, причем указанный промотор, состоит по существу из промотора гена IPNS Penicilhum chrysogenum 15 Клетка-хозяин Penicilhum chrysogenum ATCC 74187, трансформированная вектором экспрессии рекомбинантной ДНК, плазмидой pTS-8, который способен встраиваться в хромосомную ДНК указанной клетки-хозяина, где указанная плазмида состоит по существу из ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, происходящую из Cephalosponum acremonium, и промотора, который, управляет экспрессией ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, причем указанный промотор состоит по существу из промотора гена IPNS Penicilhum chrysogenum 16 Способ культивирования рекомбинантной клетки-хозяина Penicilhum chrysogenum в условиях, пригодных для экспрессии генов, отличаю 47385 щийся тем, что указанная рекомбинантная клеткахозяин содержит вектор экспрессии рекомбинантной ДНК, плазмиду pPEN/CEPH-1, который способен встраиваться в хромосомную ДНК указанной клетки-хозяина, и состоит по существу из ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную активность, происходящую из Cephalosponum acremomum, и промотора, который управляет экспрессией ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную активность, причем указанный промотор состоит по существу из промотора гена IPNS Penicilhum chrysogenum 17 Способ культивирования рекомбинантной клетки-хозяина Penicilhum chrysogenum в услови Настоящее изобретение относится к области синтетических методов изготовления коммерческих цефалоспориновых антибиотиков, в настоящее время имеется значительное количество цефалоспориновых антибиотиков, лечебные средства цефалоспориновой природы сейчас находятся в своем четвертом поколении У коммерческих цефалоспоринов обнаруживается огромное разнообразие боковых цепей, большая экономическая важность цефалоспоринов определяет повышенную значимость разработок более экономичных и эффективных методов производства ключевых промежуточных продуктов, которые позволяют легко синтезировать различные цефалоспорины Одним из ключевых промежуточных продуктов цефалоспоринов является 7-аминоцефалоспорановая кислота /7-АЦК/, которая монет быть представлена следующей формулой СООН В настоящее время 7-АЦК производится из цефалоспорина С Цефалоспорин С, сам по себе являющийся ферментационным продуктом, является исходным веществом почти для всех имеющихся в настоящее время торговых препаратов цефалоспоринов Однако, синтетические манипуляции по производству различных коммерческих цефалоспоринов в большинстве случаев начинаются, по существу, с 7-аминоцефалослорановой кислоты, которая должна быть получена из цефалоспорина С путем отщепления 7-амшоадипоиловой боковой цепи Обычные коммерческие цефалоспорины получают синтетически из 7-АЦК, в том числе и те, которые имеют 3ацетилоксиметиленовую боковую цепь, включая цефотаксим, цефалоглицин, цефалотин и цефапирин Еще одним из ключевых промежуточных продуктов является 7-аминодеацетилцефалоспорановая кислота /7-АДАЦ/, которая может быть представлена следующей формулой ях, пригодных для экспрессии генов, отличающийся тем, что указанная рекомбинантная клеткахозяин содержит вектор экспрессии рекомбинантной ДНК, плазмиду pTS-8, который встраивается в хромосомную ДНК указанной клетки-хозяина, и состоит по существу из ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, происходящую из Cephalosponum acremomum, и промотора, который управляет экспрессией ДНК, кодирующей экспандазную/гидроксилазную и ацетилтрансферазную активность, причем указанный промотор состоит по существу из промотора гена IPNS Penicilhum chrysogenum О сн 2 он СООН В настоящее время 7-АДАЦ также производится из цефалоспорина С путем удаления 7-D-aаминоадипоиловой боковой цепи вместе с превращением 3-ацетилоксиметиленовой боковой цепи в 3-гндроксиметил 7-АДАЦ применяется в качестве промежуточного соединения в синтезе цефалоспоринов, содержащих модифицированные заместители в положении С-3 В настоящее время в данной области техники предпочтительным способом отщепления 7аминоадипоиловой боковой цепи является химический способ Основной иминогалоидный процесс требует защиты амино- и карбоксильной групп 7-аминоадипоиловой боковой цепи, для достижения этого сейчас используется несколько методов Однако, процесс химического отщепления, применяемый в настоящее время, имеет серьезные недостатки Среди этих недостатков можно отметить необходимость проведения многоэтапного и сложного процесса, чрезвычайно низкие действительные температуры, дорогостоящие реактивы, значительные количества побочных продуктов этого процесса, приводящие к проблемам обработки образующейся реакционной смеси, и очистку сильно загрязненного исходного материала перед началом химической обработки Поэтому ведется непрерывный поиск микробиологического или ферментативного процесса, по которому достигалось бы ферментное деацилирование цефалоспорина С с образованием 7аминоцефалоспорановой кислоты на более экономичной основе, чем та, что имеется у используемого сейчас химического процесса Однако, этот поиск успешного микробиологического процесса оказывается в значительной степени тщетным Как становится ясно из литературы, это является результатом особенностей структуры и, в частности, стереохимии аминоадипоиловой боковой цепи молекулы цефалоспорина С, так как пенициллин успешно деацилируется ферментным расщеплением с использованием 47385 пенициллин-ацилазы, образуемой множеством микроорганизмов С другой стороны, сообщения в литературе об успешном одноэтапном ферментном деацилировании цефалоспорияа С часто являются невоспроизводимыми или обеспечивают только очень небольшие выходы конечного продукта Поэтому, настоящее изобретение главным образом относится к области изготовления ключевого цефалоспоринового промежуточного соединения 7-АЦК, а более конкретно - к области биопроцессов для производства 7-АЦК К настоящему времени поиск успешного биопроцесса для изготовления 7-АЦК остается в значительной степени тщетным, конечно же, и в отношении биопроцесса промышленного масштаба Например, в то время, как возможно прямой ферментацией и/или ферментной обработкой получить 6-амино-пенициллановую кислоту /6-АПК/, у которой остается необходимым только расширить кольцо, чтобы получить 7-АДЦК, было обнаружено, что, к несчастью, ферменты Cephalosponum или Streptomyces, которые осуществляют расширение кольца в нормальных метаболических путях этих микроорганизмов, не воспринимают 6-АПК в качестве субстрата Эти ферменты, которые в совокупности обозначаются как ДАОЦС или "фермент экспандаза" в данной области техники, определяются как ферменты, которые катализируют расширение структур пенамовых колец, найденных в молекулах пенициллинового типа, в цеф-3-емовые кольца, найденные у цефалоспоринов В дальнейшем эти ферменты будут коллективно упоминаться как "фермент экспандаза" Субстратом, на который действует фермент экспандаза, является пенициллин N, который после расширения кольца и гидроксилирования дает деацетилцефалоспорановую кислоту /ДАЦ/ Теперь для получения 7-АДАЦ необходимо только отщепить /О/-а-аминоадипоиловую боковую цепь, но эта боковая цепь оказалась упорно невосприимчивой к ферментному отщеплению, что приводит только к неприемлемо-низким выходам конечного продукта В соответствии с настоящим изобретением стало возможным проводить эффективный биопроцесс, по которому пенициллиновое соединения, /имеющее адипоиловую боковую цепь/, образуется посредством нового ферментационного процесса в высоких титрах, названное пенициллиновое соединение является приемлемым субстратом для экспандазного фермента, который образуется "в месте нахождения" тем же самым организмом, который производит и пенициллиновое соединение, трансформированным для экспрессии названного фермента экспандаза Фермент экспандаза затем осуществляет расширение кольца пенициллинового соединения с образованием цефалоспоринового соединения с высоким выходом последнего Адипоил-7-АДЦК, образуемая действием фермента экспандазы "в месте нахождения", имеет 3-метильную боковую цепь /-СНз/, тогда как 7АЦК, конечный продукт, имеет 3ацетилоксиметялъную боковую цепь [ 8 СН2ОС/О/СН3] Для того, чтобы превратить 3метильную боковую цепь в 3ацетилоксиметилъную боковую цепь, в соответствии с настоящим изобретением также "в месте нахождения" экспрессируются две другие ферментные активности в добавление к экспандазнои активности Для этого имеются гидроксилаза и ацетилтрансфераза, оба фермента являются продуктами экспрессии генов, которые также был трансформирован микроорганизм, образующий пенициллиновое соединение Гидроксилазный фермент превращает 3-метильную боковую цепь адппоил-7-АДЦК в 3-гидроксиметильную, а ацетилтрансферазный фермент превращает 3гидроксиметильную боковую цепь в 3ацетилоксиметильную боковую цепь 7-АЦК И на последнем решающем этапе метода настоящего изобретения важно то, что боковую цепь пенициллинового соединения, теперь уже цефалоспоринового соединения, можно удалить другой ферментной системой с неожиданно высокими выходами конечного продукта Непредвиденным результатом этого уникального общего биопроцесса, который включает в себя настоящее изобретение, является образование 7-АЦК с удивительно высокими выходами и экономичность, достаточная для того, чтобы представлять приемлемую альтернативу используемым в настоящее время методам, связанным с химическими и биохимическими процессами 2 Краткое описание предшествующего уровня техники Новый биопроцесс настоящего изобретения предоставляет уникальный и удивительно эффективным метод производства 7-АЦК как экономически жизнеспособную альтернативу используемому в настоящее время химическому синтезу Непрерывные попытки изобретения такого биопроцесса в данной области техники приводят к постоянно повторяющимся неудачам Например, ЕР-А-0 422 790 описывает ДНК, кодирующую изопенициллин N ацил-КоА - ацилтрансферазную активность Aspergillus mdulans, и ее использование для получения полезных цефалоспоринов с участием образующих пенициллин грибов, которое не достигалось до этого в данной области техники Но оно описывается как осуществляемое путем разрушения или перемещения ацетилтрансферазного гена вместе с добавлением генов, кодирующих ферменты эпимеразу и экспандазу, из образующих цефалоспорин организмов, кроме того, повидимому, не получено действительно полезного результата трансформации и экспрессии К тому же, если описанная трансформация была бы удачной, она все равно не была бы применима для целей настоящего изобретения, так как по прежнему оставалась бы проблема удаления D-aаминоадипоиловой боковой цепи Такая неудачная попытка получить значительные результаты по производству промежуточных продуктов в синтезе коммерческих цефалоспоринов из культур грибов, образующих пенициллин, составляет полную противоположность результатам, полученным при использовании метода настоящего изобретения Первый ферментный этап биопроцесса по ме 47385 тоду настоящего изобретения представляет собой расширение кольца у адипоил-6-АПК, которое осуществляется ферментом экспандазой, являющимся продуктом экспрессии экспандазного гена, которым был трансформирован хозяйский нерекомбивантный штамм Р Chrysogenum Использование такого экспандазного фермента уже применялось в данной области техники Например, Cantwell et al , Curr Yenet /1990/, 17 213 - 221, предложили биопроцесс для получения 7-АДЦК посредством расширения кольца пенициллина V, сопровождаемого ферментным гидролизом полученного деацетоксицефалоспорина V с образованием 7-АДЦК Это предложение основано на имеющемся в наличии гене экспандазы пенициллина N /cef E/, клонированном из S clavuhgerus, Kovacevic et al , L Bactenol /1989/, 171 754 - 760, и Ingoha et al US 5,070,020 Однако, поскольку экспандаза действует на пенициллин N, ее естественный субстрат, а не на пенициллин V, то сделанное предложение требует генно-инженерных работ по формированию модифицированного гена экспандазы, продукт которого может расширять кольцо у пенициллина V Однако, требуемая модификация не выполнена Comtwell et al, им удалось трансформировать Penicilhum chrysogenum геном cefE из Streptomyces clavuhgerus и получить экспрессию фермента ДАОЦС /экспандазы/ только на низком уровне Фермент экспандаза хорошо изучен в данной области техники как в отношении его активности, так и в отношении его генетической последовательности Например, в работах 'Wolfe /U S 4,510,246 и 4,536,476/ для предоставления стабильных ферментных препаратов из бесклеточных экстрактов образующих р -лактамы прокариотических организмов, включая Streptomyces clavuhgerus, были по отдельности выделены циклаза, эпимераза и ферменты, расширяющие кольцо Detzlaf /U S 5,082,772, ЕР-А-0 366 354/ описывает выделенный и очищенный фермент экспандазу из S Clavuhgerus который охарактеризован, включая концевые остатки и аминокислотный состав, определено также, что фермент имеет молекулярный вес около 34,600 Дальтон Однако, этот результат противоречит молекулярному весу в 29,000 Дальтон, определенному для вещества, которое очевидно, является таким же ферментом B U S 4,536,476 ЕР-А-0 233 715 описывает выделение и характеристику карты, построенной при помощи рестриктирующих эндонуклеаз, гена экспандазы, полученного из S clavuhgerus и экспрессированного рекомбинантнои кодирующей экспандазу ДНК, /дающей активный экспандазный фермент/, в штамме S Clavuhgerus, дефектного по способности образовывать цефалоспорин Ingoha et al , U S 5,070,020 /ЕР-А-0 341 892/ описывают последовательность ДНК, кодирующую фермент экспандазу, которая была получена из Р chrysogenum, также описывается трансформация штамма Р chrysogenum экспрессирующим вектором, содержащим названную последовательность ДНК, и получение тем самым экспрессии фермента экспандазы В то время, как пред 10 лагается применимость этого фермента для расширения колец у субстратов, отличающихся от пенициллина N, не представлено действительной демонстрации такого расширения колец Описанная выше работа сосредоточена на экспандазном ферменте, происходящим из прокариотического штамма S clavuhgerus Фермент, повидимому, имеющий такую же расширяющую кольцо активность, также экспрессируется у эукариотических штаммов Cephalosporum acremomum ^акже относимы к Acremomum chrysogenum/ Однако, в таких штаммах экспандазная активность экспрессируется бифункциональным геном /cefEF/, который также экспрессирует активность ДАЦС /гидроксилаза/, чьей естественной функцией является превращение дезацетоксицефалоспорановой кислоты /ДАОЦ/, продукта экспандазного фермента, в деацетил-цефалоспорин С /ДАН/ Результатом такой экспрессии является единственный, но бифункциональный фермент экспандаза/гидроксилаза Хотя и были приложены усилия по разделению активностей у продукта двойного гена, ни одна из попыток еще не имела успеха Например, ЕР-А-0 281 391 описывает выделение и идентификацию последовательности ДНК гена ДАОЦС/ДАЦС, полученного из С acremomum ATCC 11550, а также соответствующую аминокислотную последовательность фермента Штамм Penicilhum был трансформирован и экспрессировал ферменты, однако, попытки превращения пенициллинов G и V в соответствующие цефалоспорины ни разу не были продемонстрированы Далее, несмотря на то, что методы генной инженерии предлагаются в качестве легкого способа разделения генетической информации, кодирующей ДАОЦС и ДАЦС, и их раздельной экспрессии, не представлено действительной демонстрация такого разделения Фермент ДАОЦС/ДАЦС/экспандаза/гидроксилаза/ из С acremomum такке хорошо изучен в данной области техники, как в отношении его активности и ее характеристик, так и в отношении его генетической последовательности Например, в работах Demam /US 4,178,210, 4,248,966, и 4,307,192/ различные исходные материалы пенициллинового типа обрабатываются бесклеточным экстрактом С acremomum, который эпимеризует- и расширяет кольцо с образованием цефалоспоринового антибиотического продукта Wu-kuang-Yeh /U S 4,753,881/ описывает С acremomum через посредство его изоэлектрической точки, молекулярного веса, аминокислотных остатков, соотношения гидроксилазной и экспандазной активностей и пептидных фрагментов Ацетилтрансферазный фермент С acremomum также описан в данной области техники в отношении его активности, различных характеристик, рестрикционного картирования и последовательностей нуклеотидов и аминокислот Смотри, например, ЕР-А-0 437 378 и ЕР-А-0 450 758 Предшествующий уровень техники, обсуждавшийся выше, относится только к одному аспекту настоящего изобретения, а именно к трансформации штамма Р chrysogenum генами, 12 11 47385 кодирующими ферменты экспандазу и экспандаго, либо при посредстве биопроцесса, каким-либо зу/гидроксилазу и обеспечивающими экспрессию образом аналогичного тому, что описывается в этих ферментов На предшествующем уровне, настоящей спецификации/, по которому адипоилоднако, используются только экспрессированные цефалоспорин должен образовываться в первую ферменты для расширения кольца пенициллина очередь N, но не у пенициллинов G и V И даже в этом В данной области техники известно, что в тех случае у пенициллина N остается боковая цепь в случаях, где присутствует /D/-aположении 7, которую нельзя отщепить при поаминоадипоиловая боковая цепь, первой удалямощи фермента для получения свободной аминоется аминогруппа и происходит укорачивание богруппы Настоящее изобретение основано на нековой цепи с участием фермента оксидазы /D /ожиданном открытии того, что адипоиловая аминокислот, после чего остается глутариловая боковая цепь может быть эффективно добавлена /ГЛ-7/ боковая цепь, глутариловая боковая цепь штаммом Р chrysogenum, что экспандазный ферудаляется вторым ферментом мент, экспрессируемый "в месте нахождения", /глутарилацилазой/ Такое двух-этапное отщеплеможет эффективно использовать это соединение ние списывание в работах Matsuda, U S в качестве субстрата для расширения кольца с 3,960,662, ЕР-А-0 275 901, lap 61-218057 /1988 образованием 7-ФДЦК, что ферменты гидроксилаKomafsu, Asahi Chemical Jndustry Co /, WO за и ацетилтрансфераза, также экспрессируемые 90/12110/1990 - Wong, Biopure Corp/, и EP-A-0 "в месте нахождения", могут использовать адипо436 355, Jsogai et al , также Bio/Fechnology /1991/ ил-7-АДЦК в качестве субстрата с образованием 9, 188-191 3-ацетоксиметиловой боковой цепи 7-ФЦК, и что В данной области техники также известно, как адипоиловая боковая цепь затем может быть эфвыполняется одноэтапное отщепление /D/-aфективно удалена еще одним ферментом с обрааминоадипоиловой боковой цепи, в частности, с зованием 7-АЦК Тогда как различные отдельные использованием техники рекомбинантной ДНК фрагменты настоящего изобретения могут быть Смотри, например одно-этапное отщепление /D/найдены на предшествующем уровне техники, на a-аминоадипоиловой боковой цепи нем не имеется предложения объединения их для Jap 53-94093 /Meiji Pseudomonas Sp BN-188/, получения неожиданных результатов, предоставJap 52-143289/ = U S 4,141,790, Meiji, ляемых методом настоящего изобретения Aspergillus Sp /, Например, образование 6-адилоилUS 4,774,179 /Asahi, 1988, Pseudomonas Sp пенициллановой кислоты известно в данной обSE-83 и SE-495/, = lap 61-21097 и lap 61-152286, ласти, смотри Ballio et al , Nature /1960/, 185, 97 Fr Pat 2,241 557/Anes 1975, Bacillus cereus 99 Ферментное расширение кольца 6-адипоилvar fluorescens/, пенициллановой кислоты, но только на основе Jap 52-082791 /Foyo lozo 1977, Bacillus данных in vitro, также известно в данной области, megatenum NRRLB5385/, смотри Baldunn et al , Tetrahedron /1987/ 43, 3009EP-A-0 321 849 /Hoechst, Pseudomonas, 3014, и ЕР-А-0 268 343 И ферментное отщеплеBacillus subtihs, j-glutamyl transpeptidase/, ние адипоиловых боковых цепей также известно в EP-A-0 322 032, EP-A-0 405 846, и U S данной области, смотри, например, работу 5,104,800/Merck, Bacillus megatenum/, Mafsuda et al , Y Bact /1987/169, 5815 - 5820 EP-A-0 283 218 и U S 4,981,789/Merck, Адипоиловая боковая цепь имеет следующую Arthrobacter viscosus/, структуру СООН-/СН2/4-СО-, тогда как две бокоодно-этапное отщепление (рекомбинантное) вые цепи близко родственной структуры являются цеф С -» 7-АЦК, цепями глутарила, имеющего следующую формуJap 60-110292/Asahi 1985,Comamonas, peлу СООН/-СН2/з-СОи цепями /D/-aкомбинантный штамм Е coh с геном из Comamoras аминоадипоила, имеющего формулу СООНср SV-77-1, одно-этапное превращение), CH/NH2/-/CH2/3-CO- Ферментное отщепление глуJap 61-152-286 /Asahi 1986, Pseudomonas, peтариловых боковых цепей известно в данной обконбинантный штамм Е coh с геном из ласти техники Смотри, например, работы Shibuya Pseudomonas sp SE 83, генетическая последоваet al , Agnc Biol Chem /1981/ 45, 1561 - 1567, U S тельность описана и внесена в формулу изобре3,960,662, Mafeuda and Kamatsu, I Bact /1985/163, тения, одно-этапный процесс уже сформулирован 1222-1228, Mafeuda et al , I Bact /1987/169, 5815 B U S 4,774, 179/, 5820, lab 53-086084 /1978- Banyu Pharmaceutical Jap 63-74499 /Asahi 1988, Tngonopsis Co, Ltd/, и lap 52-128293 /1977 - Banyu vanabilis, .Comamonas, экспрессия в рекомбинантPharmaceutical Co , Ltd / EPA-A-0 453 048 описыном штамме Е coh конструкции оксидазы /D/вает методы улучшения отцепляющей адипоил аминокислот и ГЛ-7-АЦК-ацилазы/, активности глутарил-ацилазы, образуемой ЕР-А-0 475 652 /Fujisawa, цефалоспорин СPseudomonas S У-77-1 При замещении различных ацилаза и ее продукция посредством техники реаминокислот в определенных местах в пределах комбинантной ДНК/ альфа-субъединицы /фермента/ наблюдалась в В данной области техники известны различтри-пять раз более высокая скорость отщепления ные аспекты методов для получения 7-АДАЦ адипоила /от адипоил-серина/ Следует отметить, Смотри, например, U S 3,304,236 и 3,972,774 /Eh что хотя ЕР-А-0 453 048, очевидно, демонстрируLilly & Со /, ЕР-А-0 454 478 /Shionogi Co , Ltd /, и ет ацилазу с улучшенной активностью в отношеопубликованную Японскую заявку 04 53,499 нии адипоиловых боковых цепей, эта работа не /Shionogi Co , Ltd / описывает какого-либо способа /либо химическоСсылка на заявку, находящуюся в процессе 13 14 47385 одновременного рассмотрения Ссылка делается на находящуюся в процессе одновременного рассмотрения заявку с серийным номером 07/933,469, выданную 28 августа 1992 года /№ 185321А в проверенном списка/, которая описывает биопроцесс для получения 7-АДЦК, основанный на экспрессии активности экспандазного фермента в трансформанте Р Chrysogenum тем же способом, что и в биопроцессе для получения 7-АДАЦ и 7-АЦК, описанном здесь Однако, в настоящем биопроцессе дополнительные трансформации используются для экспрессии дополнительных ферментных активностей с целью осуществить полностью отличающийся рекомбинантныи метаболический путь для синтеза определенных конечных продуктов, ни один из которых не предлагается в заявке, находящейся в процессе одновременного рассмотрения О Н