Спосіб депонування культур в умовах in vitro

Спосіб депонування культур в умовах in vitro, що включає культивування мікророслин на агаризованому поживному середовищі, яке містить азотнокислий калій, хлористий кальцій, сірчанокислий магній, сірчанокисле залізо у хелатній формі, борну кислоту, сірчанокислий марганець, сірчанокислий цинк, йодний калій, молібдат натрію, сірчанокислу мідь, хлористий кобальт, мезоінозит, тіамін, піридоксин, нафтилоцтову кислоту, сахарозу, а культивування проводять при позитивній температурі повітря, вологості – 70%, фотоперіодичному освітленні, систематичному пересаджуванні кожні два тижні на свіже поживне середовище, який відрізняється тим, що культивування мікророслин проводять при температурі повітря 16-26°С, 8-14годинному фотоперіоді і освітленні 2-4клк на агаризованому поживному середовищі, що не потребує систематичного пересаджування мікророслин і яке додатково містить: азотнокислий амоній, фосфорнокислий калій однозаміщений, гліцин, аскорбінову кислоту, гіберелову кислоту, кінетин, нікотинову кислоту, індолілоцтову кислоту або U 2 15085 1 3 - Diaz C., Engelmann F. // Cryo Lett. - 1998. - 19. №3 - p.171-176], [Cryopreservation of apple shoot type: Importance of Cryopreservation technique and of conditioning of donor plants / WW Yongjie, Engelmann Florent, Ihao Yanhua, Lhan Mingele, Chen Shuangying // Cryo-Lett - 1999 - 20. №2 - p.121-130]. Ці способи дозволяють зберігати довготривалий час рослинний матеріал різного походження (верхівки пагонів та інші), але при цьому виживання рослин після кріоконсервації не досить висока 30-50%. Тому можливості використання методу in vitro в селекції залишаються ще не повністю реалізованими у зв'язку з відсутністю надійних методів довготривалого зберігання селекційного матеріалу. Найбільш близьким за сукупністю ознак до запропонованої корисної моделі є спосіб культивування рослин в умовах in vitro [Ильенко И.И. Микроклональное размножение стевии в культуре in vitro. Введение в культуру стевии-источника низкокалорийного заменителя сахара. К., ВНИС, 1990, с.74-79], що включає культивування мікророслин стевії на агаризованому поживному середовищі, яке містить таке співвідношення компонентів, мг на 1л води: (NH4)2 x SO4 - 134, KNO3 - 2500, CaCl2 x 2Н2О - 150, MgSO4 x 7H2О 250, NaН2РO4 x H2O - 150, Nа2ЭДТА - 37,3, FeSO4 x 7H2O - 27,85, Н3ВО3 - 3,0, MnSO4 x Н2О - 10,0, ZnSO4 x 7H2O - 2,0, KJ - 0,25, Na2MoO4 x 2H2O 9,25, CuSO4 x 5H2O - 0,025, CoCl2 x 6Н2O - 0,025, мезоінозит - 100, нікотинамід - 0,5, тіамін - 0,3, піридоксин - 0,3, нафтилоцтова кислота - 0,05-0,5, сахароза - 40000, культивування проводять при температурі повітря 26-28°С, і вологості 70%, 14годинному фотоперіоді з освітленням 3-5клк та систематичному депонуванні кожні два тижні на свіже поживне середовище. Відомий спосіб має такі спільні суттєві ознаки з корисною моделлю: культивування мікророслин на агаризованому поживному середовищі, склад компонентів, режиму культивування - освітлення, температура і фотоперіод. Однак, незважаючи на це, відомий спосіб не забезпечує довготривалого зберігання мікророслин, тому що потребує систематичних їх пересадок кожні два тижні. В основу корисної моделі поставлена задача вдосконалити спосіб депонування культур в умовах in vitro шляхом створення певних умов культивування рослин на поліпшеному поживному агаризованому середовищі, що дає змогу тривало зберігати рослини без пересадки їх на нове поживне середовище при вирощуванні рослин in vitro, що сприяє економії дорогих препаратів і робочого часу. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі депонування культур в умовах in vitro, що включає культивування мікророслин на агаризованому поживному середовищі, яке містить азотнокислий калій, хлористий кальцій, сірчанокисле залізо у хелатній формі, борну кислоту, сірчанокислий марганець, сірчанокислий цинк, йодний калій, молібдат натрію, сірчанокислу мідь, хлористий кобальт, мезоінозит, тіамін, піридоксин, нафтилоцтову кислоту, сахарозу, 15085 4 культивування проводять при позитивній температурі повітря, фотоперіодичному освітленні, систематичному пересаджуванні мікророслин кожні два тижні на свіже поживне середовище, згідно з винаходом, культивування мікророслин проводять при температурі повітря 16-26°С, 8-14-годинному фотоперіоді і освітленні 2-4клк на агаризованому поживному середовищі, що не потребує систематичного пересаджування мікророслин, і яке додатково містить: азотнокислий амоній, фосфорнокислий калій однозаміщений, гліцин, аскорбінову кислоту, гіберелову кислоту, кінетин, нікотинову кислоту, індолилоцтову кислоту або гетероауксин при такому співвідношеyні компонентів, мг на 1л води: NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2 x 2Н2О 440 MgSO4 x 7H2О 370 КН2РO4 170 Na2DТА 37,23 FeSO4 x 7H2O 27,95 Н3ВО3 6,2 MnSO4 x 4Н2О 22,3 ZnSO4 x 7H2O 8,6 KJ 0,83 Na2MoO4 x 2H2O 0,25 CuSO4 x 5H2O 0,025 CoCl2 x 6Н2O 0,025 Мезоінозит 100 Гліцин 2,0 Нікотинова кислота 0,5 Тіамін 0,1 Піридоксин 0,1 Аскорбінова кислота 1,0 Гіберелова кислота 0,25 Кінетин 0,1 Нафтилоцтова кислота 0,05-0,5 або Індолилоцтова кислота 0,2 або Гетероауксин 0,2 Сахароза 10000-40000, Серед цих суттєвих ознак корисної моделі відмінними - новими від прототипу є ознаки: культивування мікророслин проводять на поліпшеному поживному агаризованому середовищі, що не потребує систематичного депонування мікророслин і яке містить додатково гліцин, аскорбінову кислоту, гіберелову кислоту, кінетин, індолилоцтову кислоту або гетероауксин. Окрім цього поживне середовище має інший склад компонентів. А культивування мікророслин проводять при іншому режимі, так при температурі повітря 16-26°С, 8-14 годинному фотоперіоді та освітленні 2-4клк. Ці нові відмінні ознаки винаходу при взаємодії з відомими ознаками забезпечують досягнення технічного результату що проявляється в підвищенні довготривалого зберігання селекційного матеріалу в умовах in vitro і дає можливість розмножувати в необхідній кількості цінні селекційні матеріали. Впровадження запропонованого способу депонування мікророслин в умовах in vitro дає змогу значно збільшити термін зберігання рослин - до 57 місяців без пересадки на нове поживне середо 5 15085 вище, що сприяє економії дорогих матеріалів і робочого часу при вирощуванні рослин in vitro. Як видно із даних таблиць 1 та 2, ріст та розвиток рослин, що були висаджені на агаризоване середовище за пропонованим способом, був сильно уповільнений. Так, якщо через 14 діб культивування висота рослин, що були висаджені за відомим способом, була 47,0мм, то за пропонованим лише - 16,0мм. Кількість листя у першому варіанті становила 10шт., а в другому - 3шт. Через 30 діб рослини, що росли за відомим способом, доросли майже до верхівки колби і потребували пересадки, середовище потемніло. А в запропонованому варіанті рослини були зовсім маленькими 6 15-18мм з 3-5 листками. Ріст та розвиток цих рослин був уповільнений. Навіть через 5 місяців після посадки рослин середня висота їх дорівнювала тільки 39,1мм а кількість листків складала - 12. Середовище залишилось світлим і не потемніло. Рослини за виглядом були здорові, зелені, листя не пожовкло. Протягом більш 5-ти місяців мікророслини стевії, які знаходились на середовищі, уповільнено росли та розвивались, не потребуючи пересадки на нове поживне середовище, тоді як при вирощуванні за прототипом таких пересадок потрібно було зробити 8-10 (кожні 2 тижні). Таблиця 1 Вплив умов культивування на ріст мікророслин стевії № 1 2 Варіанти 0 при висадці 15 15 Прототип Винахід Висота рослин, (мм) на день заліку 14 діб 30 діб 61 доба 94 доби 122 доби 47,0 102,2 16,0 17,4 21,5 26,3 32,3 151 доба 39,1 Таблиця 2 Вплив умов культивування на динаміку росту листового апарату стевії № 1 2 Варіанти Прототип Винахід 0при висадці 2,5 2,5 Спосіб депонування культур в умовах in vitro здійснюється таким чином: Культивування мікророслин проводять на стевії (Stevia rebaudiana Bertoni), у 10-14 кратній повторності, кількість рослин у колбі 7-8шт. Для депонування рослин на запропонованому Комп’ютерна верстка Д. Шеверун Листків (шт.) на день заліку 14 діб 30 діб 61 доба 10 16 3 4 6 151 доба 12 агаризованому середовищі використовують експланти, взяті з верхньої частини рослин з довжиною стебла 15мм та 2-3 листками при температурі повітря 16-26°С, відносній вологості 70%, освітленні 2-4клк та 8-14 годинному фотоперіоді. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601