Спосіб отримання експлантів представників роду вета l. для введення в культуру in vitro

Корисна модель стосується селекції сільськогосподарських культур, зокрема, клонального мікророзмноження рослин, а саме отримання експлантів представників роду Beta L. для введення в культуру in vitro. Відомий спосіб отримання експлантів представників роду Beta L. для культури in vitro, який включає підготовку насіння, стерилізацію, промивку від речовини якою було проведено стерилізацію та висадку насіння на проростання на агаризоване середовище (Калинин Ф.Л., Сарнацкая В.В., Полищук В.Е. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - К.: Наукова думка, 1980. - 482с). Найбільш близьким за сукупністю ознак до пропонованої корисної моделі є спосіб отримання експлантів з насіння цукрових буряків (Банникова М.А., Головко А.Э., Хведынич О.А., Кучук Н.В. Регенерация растений у са харной свеклы (Beta vulgaris L.) в культуре in vitro. Гистологическое изучение процессов регенерации //Цитология и генетика, 1995. - Т.29. - №6. - С.14-22), який включає підготовку насіння, стерилізацію розчином сулеми, промивку, висадку та пророщування насіння на агаризованому середовищі, виділення експлантів та пересадку їх для подальшого культивування. Відомий і пропонований способи мають спільні суттєві ознаки, а саме підготовку насіння, його стерилізацію, промивку, висадку на поживне середовище для пророщування, виділення експлантів та пересадку їх на поживне середовище для культивування, але незважаючи на це відомий спосіб довготривалий і не забезпечує швидке проростання насіння тому, що на агаризованому середовищі досягнення повної вологоємності насіння відбувається дуже повільно. Насіння проростає нерівномірно і час проростання може сягати 30 діб, що призводить до отримання неоднорідних за віком та фізіологічним станом вибірок рослин в культурі in vitro. В основу корисної моделі поставлено задачу вдосконалити спосіб отримання експлантів представників роду Beta L. для їх швидкого введення в культур у in vitro шляхом застосування середовища в якому насіння проростає швидше, що забезпечить рівномірне надходження експлантів для використання в масових дослідженнях або при створенні культуральної бази in vitro. Поставлена задача вирішується тим, що у відомому способі отримання експлантів представників роду Beta L. для введення в культур у in vitro, який включає підготовку насіння, стерилізацію, промивку, висадку та пророщування на агаризованому середовищі, виділення експлантів і пересадку їх на інше поживне середовище, згідно з винаходом насіння пророщують у рідкому середовищі з постійним перемішуванням до появи проростків. Використання корисної моделі дозволить отримати експланти представників роду Beta L. протягом 4-6 діб, підвищить їх ви хід з насіння до 90-100% та забезпечить рівномірне надходження гомогенного за віком та фізіологічною зрілістю рослинного матеріалу для використання в масових дослідженнях або при створенні культуральної бази. Це досягається тим, що насіння пророщують у рідкому середовищі з постійним перемішуванням, що сприяє поліпшенню аерації насінин та видаленню інгібіторів проростання з тканин рослин. Для пророщування насіння використовували рідке середовище - питну воду та відоме поживне середовище Прянішнікова (рідкий субстрат). Результати дослідження проростання насіння різних представників роду Beta L. наведені в таблиці. Дослідження виявило несуттєві відмінності при проростанні насіння за умов використання в якості рідких субстратів (середовищ) питної води та поживного середовища Прянішнікова. Відсутність достовірної різниці в проростанні насіння на двох пропонованих рідких субстрата х дозволяє зробити припущення про можливість використання стерильної питної води в даному способі, що є більш простим та економічно доцільним варіантом. Це пояснюється тим, що на такий короткий період проростання насіння (до 6 діб) мінеральних речовин звичайної питної води цілком вистачає для забезпечення фази проростання. Визначено, що поодиноке насіння починає проростати з 3 доби, проте активний процес виходу проростків відбувається на 4 добу. Пік активності проростання насіння спостерігається на 5 добу - на цей момент пророслими є близько 90% насінин. Процес активного проростання потенційно життєздатного насіння завершується на 6 добу. Отже інтервалом активного проростання насіння є проміжок з 4 по 6 добу, а за оптимальний строк визначення кількості пророслого насіння прийнято 5 добу від часу висадки насіння, що й відображено в таблиці. В таблиці також наведено дані щодо виходу нестерильних експлантів. Процент інфікованого матеріалу не перевищує встановлену допустиму межу (3-4%) і таким чином отримані результати відповідають стандартам методів культури in vitro (Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. - Μ.: Наука, 1983. - 86с). Наявність нестерильного (інфікованого) матеріалу може бути зумовлена недоліками в процесі стерилізації насіння або порушенні асептичних умов роботи з матеріалом на будь якому етапі роботи. Спосіб здійснюється таким чином. З відібраних плодів буряків скальпелем знімають оплодень. Очищене насіння промивають в проточній воді та проводять попередню обробку 100% етанолом протягом кількох секунд. Надалі всі операції проводять виключно в асептичних умовах - в операційних кімнатах чи ламінар-боксах із використанням стерильного посуду та інструментів. Таблиця Проростання насіння різних представників роду Beta L. Варіанти Beta maritima Beta vulgaris var subrosea (Афьон карахісарська) Beta vulgaris Beta vulgaris (Кирмизи панджарська) Бійський однонасінний 12 Ялтушківський однонасінний 30 Ялтушківський ЧС 72 2748 АБ (селекційний номер) 1348 АЦ (селекційний номер) АБ+АЦ (селекційний номер) Контроль * Варіант 1 ** Варіант 2 *** Контроль Варіант 1 Варіант 2 Контроль Варіант 1 Варіант 2 Контроль Варіант 1 Варіант 2 Контроль Варіант 1 Варіант 2 Контроль Варіант 1 Варіант 2 Контроль Варіант 1 Варіант 2 Контроль Варіант 1 Варіант 2 Контроль Варіант 1 Варіант 2 Контроль Варіант І Варіант 2 Проростання насіння на Вихід нестерильного матеріалу, 5 добу, % % 5.0 1.0 100 — 98.0 1.0 4.0 2.0 97.0 — 94.0 — 12.0 1.0 95.0 — 98.0 — 7.0 3.0 96.0 94.0 7.0 1.0 100 96.0 11.0 3.0 100 1.0 100 — 6.0 —98 — 95 — 5.0 2.0 100 — 96.0 — 3.0 — 97.0 1.0 97.0 — 15.0 — 100 — 99.0 1.0 Позначення в таблиці: * Контроль-субстрат - агаризоване поживне середовище Мурасиге та Скуга; * * субстрат - стерильна питна вода; *** субстрат - рідке поживне середовище Прянішнікова. Підготовлене насіння стерилізують 0,2% розчином сулеми протягом 20 хвилин і промивають в стерильній воді не менше 3 разів. Стерильне насіння розкладають по одному в ємності з рідким субстратом (питна вода або поживне середовище Прянішнікова). Після цього ємності розташовують на платформі з постійним коливанням де відбувається активне перемішування насіння з рідким субстратом для досягнення необхідної вологоємності. З появою проростків ємності знімають з платформи та відставляють на стелажі для подальшого розвитку проростків. Процес пророщення відбувається при температурі 22-24°С. Насіння проростає протягом 4-6 діб. При досягненні проростками довжини 4-5см рослини вилучають з ємностей за допомогою стерильних пінцетів та мікробіологічної петлі, обрізають корені, гіпокотиль та сім'ядолі, а пагони виділені експланти - пересаджують для подальшого культивування.