Спосіб визначення активності нейтральної a-глюкозидази в еякуляті

Спосіб визначення активності нейтральної αглюкозидази в еякуляті, який включає використання мальтози як субстрату та припинення ферментативної реакції шляхом термоінактивації, який відрізняється тим, що активність нейтральної αглюкозидази визначають в еякуляті, який розводять фізіологічним розчином у 20 разів та час термоінактивації збільшують удвічі. (19) (21) u200512764 (22) 29.12.2005 (24) 17.07.2006 (46) 17.07.2006, Бюл. №7, 2006р. (72) Сербіна Ірина Євгенівна, Нуріманов Каміль Раїсович, Мигаль Людмила Якимівна, Нікуліна Галина Григорівна (73) ІНСТИТУТ УРОЛОГІЇ АМН УКРАЇНИ 3 15654 4 об'єму еякуляту із зменшенням впливу інгібітору сім'яній плазмі, до того ж це дає певні переваги: на досліджуваний фермент. по-перше, для аналізу використовують малу кільПоставлена задача вирішується тим, що спокість біоматеріалу (0,05мл), що важливо, коли кількість біоматеріалу обмежена, по-друге, цільна сіб визначення активності нейтральної сім'яна плазма - густа малопрозора рідина, і викоглюкозидази в еякуляті, який включає використанристання її в нативному стані впливає на прозоня мальтози в якості субстрату та припинення ферість реактивної суміші, що, в свою чергу, зумоврментативної реакції шляхом термоінактивації, лює отримання хибних результатів, через згідно з корисною моделю, активність нейтральної збільшення оптичної густини реактивної суміші, і,  -глюкозидази визначають в еякуляті, який розпо-третє, розведення біоматеріалу значно зменводять фізіологічним розчином у 20 разів та час шує вплив інгібіторів ферменту, які можуть бути в термоінактивації збільшують удвічі. еякуляті деяких пацієнтів, що збільшує вірогідність Спосіб визначення активності нейтральної  отримання достовірних результатів. глюкозидази в еякуляті виконують таким чином: Збільшення часу, необхідного для термоінакдля дослідження використовують сім'яну плазму, тивування ферменту пов'язане з тим, що на відміодержану після центрифугування цільного еякуляну від сечі, еякулят містить велику кількість білка ту при 3000 обертах за хвилину впродовж 10 хви(402г/л), і за 3 хвилини не відбувається повної лин. Сім'яну плазму розводять у 20 разів, для чого денатурації білка і, відповідно, повної термоінакдо 0,05мл сім'яної плазми додають 0,95мл фізіотивації ферменту, а отже при визначенні кількості логічного розчину. Розведений розчин сім'яної утвореної глюкози: специфічним глюкозооксидазплазми ретельно струшують. Надалі для аналізу ним методом після додавання робочої суміші на використовують лише розведений розчин сім'яної кінцевому етапі дослідження ферментативна реаплазми. Для визначення активності нейтральної кція розщеплення мальтози з утворенням глюкози  -глюкозидази готують субстратно-буферний триває, інтенсивність забарвлення, що розвиварозчин (8,3мМ розчин мальтози готують на 0,2М ється, продовжує збільшуватись, і це призводить фосфатному буфері, рН 6,5), для чого 30мг мальдо завищення отриманих результатів. този (М.м. мальтози - 342у.о.) розчиняють у 10мл Практичне використання способу, що пропо0,2М фосфатного буферу. У дві пробірки (дослідну нується, проведено в лабораторії біохімії та клініці і контрольну) вносять 0,2мл субстратно-буферного відділу сексопатології та андрології Інституту уророзчину В дослідну пробірку додають 0,1мл розвелогії АМН України на 66 пацієнтах з азооспермією деної у 20 разів сім'яної плазми і інкубують 30 хви(34 з екскреторно-обтураційною формою безплідлин в термостаті (t +37°С). В контрольну пробірку ності і 32 з секреторною формою) і 31 пацієнті з сім'яну плазму додають після інкубації. Обидві нормоспермією. пробірки щільно закорковують і ставлять на 6 хвиНаводимо приклади практичного застосування лин в киплячу водяну баню для термоінактивації запропонованого способу. ферментів. Після кип'ятіння ферментативна реакПриклад 1. Пацієнт Ю., і.х. №1226, звернувся в ція утворення глюкози із мальтози припиняється клініку у зв'язку з безплідністю в шлюбі. Жінку обвнаслідок денатурації ферментів. Проби охолостежено гінекологом - здорова. При объективному джують. Кількість глюкози, що утворилася внасліобстеженні пацієнта ріст волосся за чоловічим док ферментативної реакції, визначають специфітипом. Яєчка та придатки в мошонці задовільних чним глюкозооксидазним методом з розмірів, безболісні, придатки ущільнено. За ревикористанням існуючих стандартних наборів для зультатами ультрасонографії ознаки дистальної визначення глюкози в біологічних рідинах. В охообструкції відсутні. В аналізі еякуляту виявлено лоджені контрольну і дослідну пробірки з реакційазооспермію. Активність нейтральної ною сумішшю додають 1мл робочого розчину, глюкозидази в еякуляті за запропонованим спосоякий готують за інструкцією до набору. Забарвбом становила 2,4мкмоль/сл. Тестостерон сиролення розвивається за 15 хвилин при 37°С і стійке ватки крові - 6,2нг/мл (норма 3,0-12,0нг/мл). Фоліпротягом 1 години. Під час розвитку забарвлення кулостимулюючий гормон сироватки крові проби декілька разів інтенсивно струшують, інтен4,8мМО/мл (норма 1,5-5,84мМО/мл). При дослісивність забарвлення пропорційна кількості глюкодженні біоптату яєчка в просвіті більшості сім'яних зи в пробі. Оптичну щільність дослідної проби виканальців визначається біля 10 сперматозоїдів. значають проти контрольної проби на ФЕК-56 М Заключний діагноз; екскреторно-обтураційна безабо на спектрофотометрі при довжині хвилі 510нм плідність. Рекомендовано операцію епідидимова(470-540нм, зелений світлофільтр №5) в кюветі з занастомозу. довжиною оптичного шляху 3мм. Приклад 2. Пацієнт У., і.х. №2217, звернувся в Активність нейтральної  -глюкозидази в досклініку у зв'язку з безплідністю в шлюбі. Жінку облідних пробах розраховують в залежності від вестежено гінекологом - здорова. При об'єктивному личини екстинкції дослідної проби з урахуванням обстеженні пацієнта ріст волосся за чоловічим ступеню розведення біоматеріалу. типом. Яєчка та придатки в мошонці задовільних У практично здорових осіб показники активнорозмірів та консистенції, безболісні. В аналізі еясті нейтральної  -глюкозидази в сім'яній плазмі, куляту виявлено азооспермію. Активність нейтравизначеної способом, що пропонується, становльної  -глюкозидази в еякуляті за запропоновалять 20-45мкмоль/сл. Діапазон активностей, що ним способом становила 27,3мкмоль/сл. визначають, становить - 0,8-70мкмоль/сл Тестостерон сироватки крові 3,0нг/мл (норма 3,0Необхідність розведення еякуляту викликана 12,0нг/мл). Фолікулостимулюючий гормон сироватвисокою активністю нейтральної  -глюкозидази в ки крові 5,2мМО/мл (норма 1,5-5,84мМО/мл). При 5 15654 6 дослідженні біоптату яєчка визначають блок сперДжерела інформації, прийняті до уваги при екматогенезу на рівні сперматоцитів ІІ порядку. Заспертизі ключний діагноз: секреторна безплідність. Реко1. WHO Laboratory Manual for the Examination мендовано штучну інсемінацію спермою донора. of Human Semen and Sperm-Cervical Mucus Таким чином, запропонований спосіб визнаInteraction. 4th ed. Madrid: Medica Panamericana; 2001. чення активності нейтральної  -глюкозидази в 2. Лукомская И.С., Лавренова Т.П., Томилина еякуляті дозволяє ефективно проводити діагносН.А., Зубкин Н.Л., Федорова Н.Д. Диагностическое тику прохідності сім'явивідного тракту, є дуже прозначение определения активности нейтральной стим і не трудомістким у виконанні, необхідні реа -глюкозидазы и N-ацетил-  -Dгенти доступні, виконання способу потребує невелику кількість часу та біоматеріалу для досліглюкозамиинидазы в моче при патологии почек // дження. Чутливість способу 93%. Вопр, мед. химии. - 1986. - №5 - С.112-119 (прототип). Комп’ютерна верстка М. Ломалова Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601