Спосіб визначення активності тоніну у біологічних рідинах

Спосіб визначення активності тоніну у біологічних рідинах, який полягає у тому, що проводять кон'югацію маркерного ферменту з субстратом білкової природи, іммобілізацію отриманого комп 37647 В основу винаходу поставлена задача: розробки способу, специфічного для визначення активності тоніну в біологічних рідинах. Ця задача вирішується автором шляхом проведення кон'югації маркерного ферменту з субстратом білкової природи, іммобілізації отриманого комплексу на поверхні полістиролової твердої фази. Проводять протеолітичну реакцію, продукти реакції усувають відмиванням. Далі визначають залишкову активність маркерного ферменту. Відрізняючими ознаками є те, що: кон'югацію маркерного ферменту проводять із субстратом, який містить аргінін; перед проведенням протеолітичної реакції пригнічують активність трипсиноподібних протеїназ, таких як трипсин, калікреїн, шляхом додання розчину апротиніну у концентрації 20 мкг/мл та інкубації суміші протягом 5 хвилин при 37°С. Використання субстратів, які містять аргінін, забезпечує визначення активності тоніну в біологічних рідинах. Це обумовлено тим, що тонін - це калікреїн 2 (hK2), він розщеплює пептидні субстрати виключено у аргінінових залишків. Амідолітична активність, яка дорівнює 4,100 пмоль/мин на мкг hK2, оцінюється з використанням хромогенного субстрату H-D-Pro-Phe-Argпаранітроанілід. У результаті використання метоксисукциніл-Arg-Pro-Tyr-паранітроаніліду амідолітична активність не визначається. Таким чином, наявність кінцевого Arg визначає чутливість і специфічність субстрату до hK2. Слід зазначити, що зв'язок Pro-Phe розщеплюється хімазою, тому необхідно брати інший субстрат, який містить кінцевий Arg або слід наперед пригнічувати хімазу. Більша частка hK2 сімейної рідини утворює неактивний комплекс з простатспецифічним інгібітором (ПСІ). Субстрати, які похідні від ПСІ, - найбільш чутливі до hK1 і hK2 (трипсиноподібні). Субстрати, що походять від антитромбіну III і a-2антиплазміну, - більш специфічні до hK2. Активний калікреїн визначають і по розщепленню протамінсульфату. Принцип методу - визначення кількості аргініну (по реакції Сакагуші), який відщеплюється від протамінсульфату під дією калікреїну. Пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ із використанням апротиніну перед проведенням протеолітичної реакції сприяє визначенню -тоніну за рахунок усунення К1, тканевого калікреїну. Дослідження по запропонованому способу проведені в Інституті терапії АМН України. Чутливість способу - 10-9-10-10 г/мл. Відтвореність - ступінь вірогідності відмінностей не перевищує 5%. Запропонований спосіб здійснюють у такій послідовності: 1) проводять кон'югацію маркерного ферменту (пероксидази), з субстратом, який містить Arg, наприклад Arg-Arg-Lys-Ala-Ser-Gly-Pro, Arg-Ser-ArgHis-Phe або протамінсульфатом, відомим способом, можна шляхом використання метаперйодатного окислення; 2) іммобілізують утворений комплекс на поверхні полістиролових плашок, наприклад, шляхом висушення із розчину 0,5 М бікарбонату амонію. Відмивають дистильованою водою з 0,05 % твину-20; 3) готують дослідні зразки, наприклад: сироватку крові людини розводять у 250 разів 0,01 М фосфатно-солевим буфером рН 7,2-7,6 з 0,05 % твину-20; 4) пригнічують активність трипсиноподібних протеїназ, таких як трипсин, калікреїн, добавленням апротиніну у концентрації 20 мкг/мл 1:1 та інкубують суміш протягом 5 хвилин при 37°С; 5) проводять протеолітичну реакцію: утворену реакційну суміш вносять у лунки полістиролової плашки з імобілізованим комплексом пероксидазасубстрат, у контрольні зразки вносять буфер, або розчини калікреїну у концентраціях від 0,005 до 1 мкг/мл. Інкубують при 37°С протягом 15 хвилин; 6) продукти реакції усувають відмиванням як вказано раніше; 7) визначають залишкову активність маркерного ферменту. Для цього у лунки плашок вносять суміш, яка містить ортофенілендіамін (ОФД) і пергідроль у 0,1 М цитратному буфері, рН 4,5-4,6; 8) зупиняють реакцію добавленням 50% сірчаної кислоти; 9) визначають оптичну густину контрольних і дослідних зразків за допомогою багатоканального мікроспектрофотометра при 490 нм; 10) розраховують активність тоніну по розщепленню субстрату у процентах зменшення оптичної густити у дослідних зразках порівняно з контролем, де активність іммобілізованої пероксидази максимальна (100%), або по калібровочній кривій, яку будують по оптичній густині контрольних розчинів калікреїну. Можливість здійснення запропонованого способу підтверджується прикладами визначення активності тоніну в біологічних рідинах. Приклад 1. Визначення активності тоніну в сироватці крові із використанням як субстрату протамінсульфату. Здійснюють кон'югацію маркерного ферменту, наприклад, пероксидази з протамінсульфатом методом перйодатного окислення. Іммобілізують утворений комплекс на полістиролових плашках шляхом висушення при 37°С із розчину 0,5 М бікарбонату амонію. Відмивають 2-3 рази дистильованою водою з 0,05 % твину-20. Для проведення протеолітичної реакції окремо на титровальній дошці готують дослідні зразки сироватки крові людей, які розводять у 125-250 разів 0,01 М фосфатно-солевим буфером з 0,05 % твину-20. Пригнічують активність трипсиноподібних протеїназ, таких як трипсин, калікреїн, добавленням у дослідні зразки 1:1 розчину апротиніну у концентрації 20 мкг/мл та інкубують суміш при 37°С протягом 5 хвилин. Проводять протеолітичну реакцію: реакційну суміш вносять у лунки полістироловоЇ плашки з імобілізованим комплексом пероксидаза-протамінсульфат, у контрольні зразки вносять лише буфер. Інкубують плашки при 37°С протягом 15 хвилин, а потім продукти реакції усувають відмиванням як вказано раніше. Далі визначають залишкову активність маркерного ферменту шляхом додання у лунки плашок 2 37647 по 100 мкл суміші, яка містить 2 мг ОФД, 10 мкл пергідролю у 10-12 мл 0,1 М нітратного буфера рН 4,5-4,6. Зупиняють реакцію додаванням 50% сірчаної кислоти по 50 мкл у лунку. Оптичну густину визначають при 490 нм за допомогою багатоканального мікроспектрофотометра типу "Flow" (Великобританія). Розраховують активність тоніну у процентах по розщепленню субстрату у дослідних зразках порівняно з контролем за формулою: B 100 %, A де А - оптична густина контрольного зразку у одиницях екстинції, В - оптична густина дослідного зразку у одиницях екстинції, 100 - коефіцієнт перерахунку у проценти. Приклад 2. Визначення активності тоншу у біологічних рідинах із використанням пептидного субстрату. Здійснюють кон'югацію маркерного ферменту (пероксидази) з Arg-субстратом, наприклад ArgArg-Lys-Ala-Ser-Gly-Pro, Arg-Ser-Arg-His-Phe або інш., методом перйодатного окислення. Імобілізують утворений комплекс на полістиролових плашках шляхом висушення із розчину 0,5 М бікарбонату амонію. Відмивають плашки 23 рази дистильованою водою з 0,05 % твину-20. Готують дослідні зразки біологічної рідини, наприклад тканеві екстракти серця, легень, печінки, нирок, мозку щурів. Вносять у лунки титровальної дошки біологічні рідини по 200 мкл. Проводять реакцію пригнічення активності трипсиноподібних протеїназ, таких як трипсин, калікреїн, для цього додають у дослідні зразки 1:1 розчин апротиніну у концентрації 20 мкг/мл та інкубують суміші при 37°С протягом 5 хвилин. Потім реакційну суміш вносять у лунки полістиролової плашки з іммобілізованим комплексом пероксидаза-субстрат, у контрольні зразки, вносять лише буфер. Проводять протеолітичну реакцію шляхом інкубації полістиролових плашок при 37°С протягом 15 хвилин, а потім відмивають їх як вказано раніше. Для проведення кольорової реакції додають у лунки плашок суміш, яка містить 2 мг ОФД, 10 мкл пергідролю у 10 мл 0.1 М цитратного буфера рН 4,5-4,6. Зупиняють реакцію доданням 50% сірчаної кислоти по 50 мкл у лунку. Оптичну густину визначають при 490 нм за допомогою багатоканального мікроспектрофотометра типу "Flow" (Великобританія). Розраховують активність тоніну у процентах по розщепленню субстрату у дослідних зразках порівняно з контролем за формулою: B 100 %, A де А - оптична густина контрольного зразку у одиницях екстинції, В - оптична густина дослідного зразку у одиницях екстинції, 100 - коефіцієнт перерахунку у проценти. Висновок: використання запропонованого способу забезпечує одночасно високу чутливість проведення аналізу та специфічність визначення активності тоніну у біологічних рідинах, що сприятиме поширенню можливостей діагностики та контролю лікування. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3