Спосіб визначення сумарного вмісту n-нітрозамінів

Изобретение относится к области медицины и предназначено для определения суммарного содержания как летучих, так и нелетучи х Nнитрозаминов в объектах окружающей среды (воде, почве, пищевых продуктах и т.д.) и биосубстратах. В объектах окружающей среды и биосубстратах могут иметься как летучие, так и нелетучие N-нитрозамины, обладающие канцерогенной и мутагенной активностью. Известные способы определения содержания нитрозаминов включают в себя такие этапы, как выделение, очистка, концентрирование, а также разделение ряда нитрозаминов или их производных. Они требуют для разделения и детекции много времени и дорогостоящих приборов (хромато-масс-спектрометра, газового или ВЭФ жидкостного хроматографа и т.д.). Их возможности распространяются только на летучие N-нитрозамины и ограничены наличием образцов последних, необходимых для калибровки указанных приборов (см.: Костюковский Я.Л., Меламед Д.Б. Канцерогенные N-нитрозоамины. Образование, свойства, анализ // Успехи химии. - 1988. - L.VII. - Вып.4. - С.625 655). Для определения суммарного содержания летучи х и нелетучи х N-нитрозаминов известен способ, согласно которому N-нитрозамины выделяют из объекта окружающей среды в органический растворитель, денитрозируют добавлением к нему раствора бромистого водорода (HBr) в ледяной уксусной кислоте и образовавшийся из N-нитрозаминов нитрозилбромид определяют с помощью реактива Грисса (Eisenbrand G., Preussman R. Determination of a non-volative N-nitrosamine - ArzneimittolForsch., 1970, v.20, p.1513). Однако этот способ является малочувствительным и требует дополнительных действий по отделению Nнитрозаминов от красящих и замутняющих раствор веществ. Наиболее близким к заявляемому по совокупности признаков (прототипом) является способ определения суммарных N-нитрозаминов, при котором N-нитрозамины выделяют из объекта окружающей среды или биосубстрата органическим растворителем, затем к ним добавляют раствор бромистого водорода в ледяной уксусной кислоте, а образованный при этом из N-нитрозаминов летучий нитрозилбромид с помощью газообразного азота удаляют из раствора и транспортируют через соответствующие ловушки, где он освобождается от сопутствующего органического растворителя и бромида, дальше уже в виде оксида азота в термальный анализатор. В последнем количество оксида азота, а следовательно и суммарных Nнитрозаминов, являющихся его источником, измеряют по интенсивности хемилюминесценции, возникающей при реакции этого вещества с озоном (Wallers C.L et. al. Determination of a nonvolative N-nitrosamine on a food matrix Analist, 1978, v.103, p.1127 - 1133). Но этот способ, обладая высокой чувствительностью, тем не менее не обеспечивает качества, в частности воспроизводимости, результатов определения суммарного содержания N-нитрозаминов в связи с тем, что для своей реализации использует газообразование смеси и сложные устройства, направленные на их улавливание и транспортировку к термальному анализатору. Последний к тому же является остродефицитным и дорогостоящим прибором. Задачей изобретения является разработка способа определения суммарного содержания Nнитрозаминов, позволяющего за счет введения новых приемов по удалению из раствора продукта денитрозирования N-нитрозаминов и его детекции с помощью ЭПР-спектрометра снизить число промежуточных операций, время и расходы затрачиваемые на определение N-нитрозаминов в пробе и таким образом обеспечить экспресность и воспроизводимость данных определения. Поставленная задача решается тем, что в способе определения суммарного содержания Nнитрозаминов после их выделения из объектов окружающей среды в органический раствор и денитрозирования добавлением к нему ледяной уксусной кислоты, содержащей HBr, добавляют растворы ионов двухвалентного железа и диэтилдитиокарбамата, сформировавшийся при этом нитрозильный железо-серный комплекс переводят в органическую фазу встряхиванием и определяют в нем с помощью ЭПРрадиоспектрометра по величине сигнала количество оксида азота. Способ осуществляется в следующей последовательности: N-нитрозамины выделяют из исследуемого объекта (пищевой продукт, почва, вода, резина и т.д.) в органический растворитель, например, хлороформ, многократной экстракцией, обезвоживают с помощью Na2SO4 и концентрируют до определенного объема. В стеклянные пробирки с хорошо притертыми пробками вносят определенные аликвоты полученного хлороформного экстракта, содержащего суммарные N-нитрозамины или известное количество определенного Nнитрозамина (стандарт). В одни из пробирок, содержащих пробы с N-нитрозаминами исследуемого объекта, и стандартным раствором добавляют ледяную уксусную кислоту в количестве 0,4 от объема исходной аликвоты (эти пробы служили контролем на содержание нитрита в реактивах и растворе выделенных Nнитрозаминов), а в другие - такие же объемы раствора 3% HBr в ледяной уксусной кислоте. Затем инкубируют в течение 15 минут при комнатной температуре, приливают по 4 аликвоты раствора, содержащего сульфат железа (2+) и лимонную кислоту (оба по 1,0 грамм на литр) и водного раствора диэтилдитиокарбамата (1,0 грамм на литр) после чего пробирки закрывают пробками и встряхивают до тех пор, пока сформировавшийся железо-серный комплекс не перейдет в хлороформную фаз у. После этого водный слой удаляют, а раствор комплекса в хлороформе переносят в кварцевую тр убку (диаметром 3 мм) и помещают в резонатор ЭПРспектрометра. Измерения проводят при следующих параметрах: диапазон изменения магнитного поля 2800 - 3200Тл; частота СВЧ поля 9,3 - 9,8GГц; мощность 5мВт; амплитуда модуляции 2Gs. Сигнал нитрозильного комплекса железа с диэтилдитиокарбаматом представляет собой синглетный сигнал (g = 2,037) с характерной тонкой структурой (график 1). Следующий пример подтверждает осуществление предлагаемого способа: В ряд стеклянных пробирок объемом около 20мл, которые снабжены шлифами с хорошо притертыми к ним пробками, вносят по 1мл хлороформа, содержащего в возрастающих количествах: 0,01; 0,02; 0,03; 0,04 и т.д. мкгдиэтилнитрозамина. В контрольные пробирки вносят по 1мл чистого хлороформа. Затем в каждую из пробирок последовательно и быстро добавляют по 4мл 0,1% - ного раствора FeSO4 × 7Н2O и 0,1% ного раствора диэтилдитиокарбамата натрия (C5H10NS2Na), закрывают пришлифованными пробками и энергично встряхивают до те х пор, пока образовавшийся железосерный комплекс не перейдет в хлороформ. После этого водный слой удаляют, а раствор комплекса в хлороформе переносят в кварцевую трубк у (диаметром 3мм) и помещают в резонатор ЭПР-спектрометра. Измерения проводят при следующи х параметрах: диапазон изменения магнитного поля 2800 3200Тл; частота СВЧ поля 9,3 - 9,8GГц; мощность 5мВт; амплитуда модуляции 2Gs. Зависимость величины сигнала нитрозильного комплекса железа с диэтилдитиокарбаматом от количества диэтилнитрозамина представлена на графике 2. Из него видно, что эта зависимость прямо пропорциональна и чувствительность определения достигает 0,01мкг N-NO.