Спосіб активації розвитку in vitro ооцит-кумулюсних комплексів ссавців

Спосіб активації розвитку in vitro ооциткумулюсних комплексів (ОКК) ссавців, що включає виділення ОКК, вплив електричними імпульсами і культивування in vitro, який відрізняється тим, що об’єктами впливу є щойно виділені ОКК, які перед культивуванням для активації їх розвитку піддають дії електричних імпульсів з енергією 0,7-2,8 мкДж безпосередньо в середовищі для виділення ОКК. (19) (21) a200602084 (22) 27.02.2006 (24) 15.12.2006 (46) 15.12.2006, Бюл. № 12, 2006 р. (72) Шигимага Віктор Олександрович, Колеснікова Алла Олександрівна (73) ІНСТИТУТ ТВАРИННИЦТВА УКРАЇНСЬКОЇ АКАДЕМІЇ АГРАРНИХ НАУК 3 19077 4 вані або дозрілі in vitro, діють електричним імпульпульсу), тривалості та кількості імпульсів замінюсом або частіше пачкою імпульсів певної напруги, ється однією універсальною характеристикою тривалості та кількості у пачці, причому, для знисумарною енергією за час дії імпульсної обробки. ження витрат енергії імпульсу на провідність буПоставлене завдання вирішується тим, що у ферного середовища, що містить багато солей, відомому способі активації розвитку ооцитів, який імпульсну активацію проводять у проміжних невключає виділення ОКК, вплив електричними імпровідних середовищах, що містять цукри, наприпульсами і культивування in vitro, згідно винаходу, клад, сахарозу або багатоатомні спирти, наприоб’єктами впливу є щойно виділені ОКК, які перед клад, маніт в ізотонічній концентрації [Zimmermann культивуванням для активації їх розвитку піддають U., Neil G.A.. Electromanipulation of cells. N.Y.: CRC дії електричних імпульсів з енергією 0,7-2,8мкДж Press.-1996.- 375p.]. безпосередньо в середовищі для виділення ОКК. Однак, і цей спосіб не забезпечує коректної Запропонований спосіб призначений для підактивації (запуску мейозу) при дозріванні ОКК in вищення шляхом активації ефективності дозріванvitro, оскільки передбачає додаткове попереднє ня жіночих гамет ссавців при виконанні дослідникультивування ооцитів протягом декількох годин цьких та інших робіт у лабораторіях НДІ або до завершення їх дозрівання перед імпульс(наприклад, реконструкції ембріонів тварин, в тому ною активацією. У цьому способі попереднє кульчислі й клонування) та інших галузях біології відттивування власне і є першим природним запуском, ворення. Він полягає у тому, що ооцити у складі який передує другому штучному імпульсному, який ОКК видаляються шляхом проколу антральних в даному випадку порушує синхронізованість профолікулів яєчника у фосфатно-сольовому буфері цесу мейозу у природно запущеній програмі розДюльбеко (ФСБД) з додаванням 15% фетальної витку ОКК. Крім того, цей спосіб потребує додатсироватки теляти. Для подальшої роботи у тому ж кових трудовитрат (маніпуляцій) по переносу середовищі добираються ооцити з багатошаровим клітин у проміжне непровідне середовище та кількомпактним кумулюсом та рівномірно гранульовакаразовому відмиванню клітин перед ним та після ною цитоплазмою. Далі, безпосередньо у тому ж нього. До того ж, не виключений неконтрольовасамому середовищі, до поодинокого ОКК або груний негативний вплив на ооцити цього проміжного пи ОКК подають імпульсну напругу з генератора середовища, додаткова контамінація та ризик через мікроелектроди. Подача імпульсної напруги ушкодження або повної втрати клітини в процесі саме у такий спосіб не приводить до контамінації цих маніпуляцій. Стосовно величини підведеної до середовища з біоб’єктами. При цьому енергія імооциту енергії імпульсної обробки - вона у цьому пульсної обробки ОКК легко визначається та контспособі не встановлена і, як наслідок, не контроролюється по вихідній напрузі генератора, тривалюється. Останнє може викликати необгрунтоване лості та кількості імпульсів, а також попередньо перевищення рівня припустимого впливу на ооциодноразово визначеній провідності середовища. ти імпульсним електричним полем з необоротним Регулюючи вихідну напругу генератора, тривалість пробоєм мембран у тому числі і ядра з різним стута кількість імпульсів, домагаються таких їх знапенем руйнування генетичного апарата ооциту в чень, щоб не досягти руйнівного рівня підведеної залежності від величини підведеної ззовні енергії. ззовні енергії, а саме, не виходячи за межі 0,7Це може привести до різних генетичних аномалій, 2,8мкДж на клітину. Причому, при підведенні енерщо можуть мати наслідки від небажаних мутацій гії нижче 0,7мкДж активація практично неефективта відхилень у розвитку до повного припинення на, а при значеннях підведеної енергії вище розвитку ооциту. 2,8мкДж починаються пошкодження генетичного В основу корисної моделі поставлено завданапарату ооцитів. В реальних умовах зручно фіксуня удосконалити спосіб імпульсної активації ооцивати вихідну напругу генератора та тривалість тів ссавців шляхом контрольованого підсилення імпульсу, змінюючи лише їх кількість. Тоді при заприродної програми розвитку щойно виділених здалегідь відомій провідності середовища енергія ОКК імпульсною ініціалізацією (запуском) процесу визначається шляхом добутку квадрату напруги на мейозу, тобто імпульсною дією на ОКК, коли ооцит провідність, тривалість та кількість імпульсів. Після ще не зрілий і тісно пов’язаний з оточуючими його імпульсної активації ОКК помішують у культуральклітинами гранульози. Такий запуск, будучи більш не середовище для дозрівання, наприклад природним, ніж у прототипі, не погрожує порушенWaymouth MB 752/1 з добавками та здійснюють ням синхронізованості розвитку ооциту і клітин дозрівання ОКК у термостаті при фізіологічній тегранульози. Запропонований спосіб на відміну від мпературі у вологій атмосфері з 5%-ним вмістом відомих аналогів та прототипу передбачає вплив СО2. на щойно виділений ОКК або групу ОКК. УдоскоПриклад 1. У якості модельного об’єкту вибраналення способу активації забезпечується також ні ОКК миші. Виділені та відібрані за станом кумушляхом виключення додаткового етапу маніпулялюсу та цитоплазми ОКК миші випадковим чином цій з ооцитами та імпульсної дії на них у непровідрозподіляються на дослідні та контрольну групи і ному середовищі, що додатково зменшує також до початку культивування час їх перебування в ризик контамінації та/або утрати клітини. При цьоФСБД однаковий. Далі безпосередньо у цьому ж му, рівень імпульсного впливу на ОКК при активасередовищі до щойно виділеного ОКК за допомоції є контрольованим у припустимому інтервалі гою мікроелектродів подають імпульсну напругу, значень енергії, що не руйнує генетичний апарат звичайно 14В з тривалістю імпульсів 50мкс, кільклітини, і це є перевагою. Рівень впливу визначакість змінюється від 1 до 8 імпульсів дозовано. ється дуже просто: встановлення трьох величин (у Попередньо визначена провідність середовища прототипі) - напруженості поля (або амплітуди імФСБД складає приблизно 70мкСм. Шляхом добут 5 19077 6 ку квадрату напруги на провідність, тривалість та ктивним застосування для активації розвитку ОКК кількість імпульсів визначена сумарна енергія, яка електричних імпульсів з енергією 5,6мкДж (табл. становить у різних дослідних групах ОКК 0,7; 1,4; 1). За цими даними вибрано приблизно середнє 2,8; 3,5 та 5,6мкДж на клітину. Після цього ОКК значення енергії в межах допустимої, при застосудослідних та контрольної групи культивують у севанні якого підвищується ефективність розвитку in редовищі Waymouth MB 752/1, доповненому бікарvitro ОКК та яке сприяє найбільш результативній бонатом натрію, піруватом натрію та 15% фетальактивації, а саме 1,4мкДж. ної сироватки теляти, протягом 16год. Приклад 2. Відібрані і розподілені на дослідну Цитогенетичний аналіз з метою визначення стану та контрольну групи ОКК миші знаходяться безпогенетичного апарату ооцитів проводять за метосередньо у ФСБД, до ОКК дослідної групи подають дом Тарковського. Зокрема, за отриманими даниімпульсну напругу з параметрами, як у прикладі 1, ми дозрівання ОКК миші in vitro виявилося неефез кількістю імпульсів 2. Таблиця 1 Ефективність дозрівання in vitro OKK миші в залежності від енергії імпульсної обробки, (%) Дослід Енергія, мкДж 2,8 75,0 Контроль 58,8 0,7 62,5 1,4 76,1 За цими параметрами сумарна енергія складає 1,4мкДж. Через 16год. культивування у середовищі Waymouth MB 752/1 з добавками OKK, піддані дії електричних імпульсів, виявили у середньому 76,1%-ну ефективність дозрівання in vitro, в той час як у контрольній групі цей показник 3,5 40,0 5,6 0 склав 58,8%. Проведене in vitro осіменіння дозрілих OKK цих груп показало більш високий рівень запліднення ооцитів, які піддавали дії імпульсної активації розвитку (відповідно 20,0 та 36,4%) (табл. 2). Таблиця 2 Дослідні дані з розвитку in vitro OKK миші, підданих дії найбільш результативної за ефективністю імпульсної обробки (1,4мкДж) Номер досліду 1 2 3 4 5 Середнє Дозрівання, п(%) Контроль Дослід 3/5(60,0) 6/9(66,7) 4/7(57,1) 8/9(88,9) 8/10(80,0) 10/12(83,3) 2/7 (28,6) 5/8(62,5) 3/5(60,0) 6/8(75,0) 20/34(58,8) 35/46(76,1) Запропонований спосіб активації розвитку OKK in vitro шляхом контрольованого за енергією зовнішнього підсилення природної програми розвитку об’єднує переваги імпульсної електричної дії на ооцит, запропонованої в прототипі, з перевагами дії саме на щойно виділені OKK, застосовуючи Комп’ютерна верстка Л. Купенко Запліднення, п(%) Контроль Дослід 0/2(0) 2/5(40,0) 1/3(33,3) 2/6(33,3) 1/5(20,0) 4/11(36,4) цю дію на них безпосередньо у буферному середовищі. До того ж, запропонований спосіб надає можливість легко управляти процесом активації завдяки перевагам використання електричного принципу імпульсної дії на OKK. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601