Середовище для вирощування зигот корів ранніх стадій розвитку in vitro

Середовище для вирощування зигот корів ранніх стадій розвитку in vitro, що включає типове синтетичне середовище, фетальну сироватку, еструсну сироватку корів, клітини гранульозного шару фолікулів, інсулін і гепарин, яке відрізняється тим, що у складі його використано синтетичне середовище типу RPMI-1640 і Корисна модель належить до галузі репродуктивної біотехнології, зокрема до середовищ для вирощування зигот корів, а саме до середовищ для вирощування ранніх стадій зигот in vitro. Корисна модель може бути використана в біотехнологічних центрах, племзаводах і підприємствах з різними формами власності що здійснюють трансплантацію ембріонів для вдосконалення порід великої рогатої худоби, покращення генетико-селекційних якостей та підвищення продуктивності маточного стада корів. Для культивування передімплантаційних ембріонів великої рогатої худоби відомі і використовуються такі поживні синтетичні середовища: 1) Бріггерса з антибіотиками (50мкг/мл стрептоміцину і 100 од/мл пеніциліну) і 1-4мг/мл альбуміну; ["Методические рекомендации по культивированию ооцитов и фолликулов коров" / под. ред. Голубева А.К., Ленинград, ВНИИР и ГСЖ. -1989. -36с] 2) ТС-199 з 20% фетальної сироватки і антибіотики (50мкг/мл стрептоміцину і 100од/мл пеніциліну); ["Оценка качества эмбрионов додатково введено гомогенат слизової з верхньої третини рогу матки при такому співвідношенні компонентів (мас. %): фетальної сироватки 8-12 еструсної сироватки корів 8-12 клітин гранульозного шару фолікулів 5-7млн. клітин/мл інсуліну (40 од/мл) 0,25-0,35 гепарину (5 тис.од.) 0,0005-0,0015 гомогенату слизової з верхньої ттретини матки 8-12 синтетичного середовища RPMI-1640 до 100% крупного рогатого скота" Кауффольд Г.Г., Талии И., Шихов И.Я. та інші-1990.-56с] 3) Хем Ф-10 з додаванням 10% гомологічної сироватки. ["Методические рекомендации по культивированию ооцитов и фолликулов коров" / под. ред. Голубева А.К, Ленинград, ВНИИР и ГСЖ.-1989.-36с] При культивуванні зигот з використанням проміжних реципієнтів (вівці, кролі), овоцити, після запліднення, пересаджують в ампулярну частину яйцепроводу (10-20 овоцитів в один яйцепровід). Проміжних господарів попередньо обробляють інтравагінально прогестероном і гонадотропіном. Через 6-7 діб ембріони вимивають, оцінюють стадії розвитку (морули і бластоцисти) та пересаджують не хірургічним способом реципієнтам, які перед тим обробляють гормонами. Проте, здатність до виживання ембріонів при культивуванні в синтетичному середовищі низька, а при використанні реципієнтів - необхідні додаткові затрати на утримання тварин та гормональну обробку. Найбільш близьким по суті до середовищ, що заявляється, є середовище для культивування « СО 00 СО 6386 ооцит-кумулюсних комплексів корів [Яблонський В.А., Старостка В.В, Гузеватий О.Є., Ясінський В.В. "Вплив клітин кумулюсу на дозрівання, запліднення in vitro і подальше культивування ооцит-кумулюсних комплексів корів" / Вісник аграрної науки. -1994. -№4. -С.83-86.]. Відоме середовище містить типове синтетичне середовище з додаванням фетальної сироватки, еструсної сироватки корів, клітини гранульозного шару фолікулів, інсулін і гепарин. Середовище забезпечує підвищення кількості морфологічнонормальних морул і бластоцист, тобто підвищує ефективність біотехнологічного процесу. Недоліки відомого середовища полягають в необхідності додаткових витрат на його виготовлення і недостатній його ефективності для отримання більшого числа зигот на стадії бластоцисти. Заявлене нами середовище усуває недоліки прототипу і забезпечує повноцінний розвиток зигот корів на ранніх стадіях та отримання на 7,4% більше бластоцист ніж при використанні середовища - прототипу. В основу корисної моделі покладено завдання розробити середовище для ефективного культивування зигот великої рогатої худоби ранніх стадій розвитку, яке б забезпечувало повноцінний розвиток зигот in vitro, усувало тривалу підготовку до культивування, було просте у виробництві і застосуванні. Технічний результат досягають шляхом використання синтетичного середовища типу RPMI-1640 (готовий продукт) та додаткового внесення в середовище гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки, при такому співвідношенні компонентів (в мас. %): фетальної сироватки 8-12% еструсної сироватки корів 8-12% клітин гранульозного шару фолікулів 5-7млн.клітин/мл. інсуліну (40од/мл) 0,25-0,35 гепарин (бтис.од.) 0,0005-0,0015 гомогенат слизової з верхньої третини матки 8-12% синтетичне середовище КРМІ-1640 до 100% Ефективність середовища ґрунтується на оптимальному співвідношенні складових синтетичного середовища RPMI-1640 (амінокислот, антиоксидантів, мінеральних солей, енергетичних субстратів - глюкози, пірувату, сукцинату) та симбіозі органел тканини слизової матки з культурою клітин (гранульозного шару фолікулів та запліднених ооцитів). Органели тканини слизової матки здатні частково засвоювати прості органічні компоненти середовища і синтезувати необхідні біологічноактивні сполуки для повноцінного розвитку запліднених овоцитів і, таким чином, забезпечувати та нормалізувати перебіг фізіологічних процесів в зиготах ранніх стадій розвитку. Симбіоз органел тканини слизової матки та культури клітин обумовлює отримання більшої на 7,4% кількості зигот порівняно з прототипом. При проведенні заявником патентноінформаційного пошуку знайдено технічне рішення, в якому є ряд суттєвих ознак, спільних із заявленим - культивування зигот в синтетичних середовищах з додаванням фетальної сироватки, еструсної сироватки корів, клітин гранульозного шару фолікулів, інсуліну і гепарину ["Вплив клітин кумулюсу на дозрівання, запліднення in vitro і подальше культивування ооцит-кумулюсних комплексів корів" / Яблонський В.А., Старостка В.В, Гузеватий О.Є., Ясінський В.В. // Вісник аграрної науки. -1994. -№4. -С.8386.]. Однак, даних суттєвих ознак недостатньо для одержання технічного результату заявленого рішення. Технічних рішень, які б за сукупністю ознак повністю співпадали з ознаками заявленого середовища культивування зигот корів ранніх стадій розвитку in vitro не знайдено. Це дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого технічного рішення критерію корисної моделі "новизна". В джерелах патентної і науково-технічної інформації не знайдено відомостей про середовища для культивування зигот корів ранніх стадій розвитку in vitro, які б містили ознаки, що відрізняють заявлений корисну модель від прототипу: використання синтетичного середовища RPMI-1640 з додатковим введенням гомогенату слизової з верхньої третини рогу матки, при такому співвідношенні компонентів (в мас. %): фетальної сироватки 8-12% еструсної сироватки корів 8-12% клітин гранульозного шару фолікулів 5-7млн.клітин/мл інсуліну (40од/мл) 0,25-0,35 гепарин (бтис.од.) 0,0005-0,0015 гомогенат слизової з верхньої третини матки 8-12% синтетичне середовище RPMI-1640 до 100% Отже, заявлене технічне рішення не випливає явним чином з рівня техніки, що дозволяє зробити висновок про відповідність заявленого рішення критерію корисної моделі "винахідницький рівень". Корисна модель може бути використана в біотехнологічних центрах, племзаводах і підприємствах з різними формами власності, що здійснюють трансплантацію ембріонів для вдосконалення порід великої рогатої худоби, покращення генетико-селекційних якостей та підвищення продуктивності маточного стада корів і тому відповідає критерію корисної моделі "промислова придатність". Таким чином, заявлене технічне рішення є новим промислово придатним і має винахідницький рівень, тобто відповідає всім умовам патентної спроможності корисної моделі відповідно до статті 7 розділу II Закону України "Про охорону прав на винаходи і корисні моделі" (№1771-111, 2000р.). Для реалізації заявленої корисної моделі необхідно приготувати гомогенат слизової з верхньої третини рогу матки (фізіологічний стан 6386 яєчника - фолікулярне зростання; домінуючий фолікул діаметром більше 2см). Для цього, після забою корів, відбирають тканину верхньої третини рогу матки. Ріг матки розрізають, промивають фізіологічним розчином (0,9%-ним натрій хлористим), відпрепаровують слизову від м'язової тканини, та готують гомогенат. Для цього відважують 0,3 г тканини слизової і додають Змл синтетичного середовища RPMI-1640, охолодженого до +4°С. Гомогенізують в гомогенізаторі Поттера. Центрифугують при 12000д протягом 15 хвилин. Надосадову рідину обережно відсмоктують, розливають у флакони по 0,5мл і заморожують. При дотриманні умов антисептики, додаткової стерилізації гомогенат не вимагає. Використовують гомогенат в складі синтетичного середовища RPMI-1640 в дозі 812,0% від об'єму середовища. Для оцінки ефективності заявленого середовища для вирощування зигот корів ранніх стадій розвитку in vitro і визначення оптимальної дози компонентів в складі середовища було проведено досліди конкретного виконання рішення. В умовах лабораторії було виготовлено 4 партії середовищ: 1 - партія - прототип, 2, 3, 4 дослідні партії заявленого середовища при мінімальній, середній і максимальній дозі компонентів середовища. Відповідно середовища містили: 1. партія - прототип. Синтетичне середовище містило такі дози компонентів: 10% фетальної сироватки, 10% еструсної сироватки корів, клітини гранульозного шару фолікулів (5-7x106 клітин/мл з антральних фолікулів діаметром до 4мм без ознак атрезії), 0,3% інсуліну (40од/мл), 0,001% гепарину (бтис.од.). ["Вплив клітин кумулюсу на дозрівання, запліднення in vitro і подальше культивування ооцит-кумулюсних комплексів корів" / Яблонський В.А., Старостка В.В, Гузеватий О.Є., Ясінський В.В. // Вісник аграрної науки. - 1994. - №4. - С 83-86.]. 2. партія середовища дослідна містила мінімальну дозу компонентів (в мас. %): 8% фетальної сироватки, 8% еструсної сироватки корів, клітини гранульозного шару фолікулів 6 (5x10 клітин/мл з антральних фолікулів діаметром до 4 мм без ознак атрезії), 0,25% інсуліну (40од/мл), 0,0005% гепарину (бтис.од.), 8% гомогенату слизової з верхньої третьої рогу матки, синтетичне середовище RPMI-1640 - до 100%. 3. партія середовища дослідна - містило середні дози компонентів (в мас.%): 10% фетальної сироватки, 10% еструсної сироватки корів, клітини гранульозного шару фолікулів 6 (6x10 клітин/мл з антральних фолікулів діаметром до 4мм без ознак атрезії), 0,3% інсуліну (40од/мл), 0,001% гепарину (5тис.од.) та 10% гомогенату слизової з верхньої третьої рогу матки, синтетичне середовище RPMI-1640 - до 100%. 4. партія середовища дослідна - синтетичне середовище RPMI-1640 містило максимальні дози компонентів (в мас.%): 12% фетальної сироватки, 12% еструсної сироватки корів, клітини гранульозного шару фолікулів (7x10 6 клітин/мл з антральних фолікулів діаметром до 4мм без ознак атрезії), 0,35% інсуліну (40од/мл), 0,0015% гепарину (5тис.од.), 12% гомогенату слизової з верхньої третьої рогу матки, синтетичне середовище RPMI-1640 - до 100%. Овоцити, отримані аспірацією з фолікулів менше 7мм, запліднювали сперміями, які отримували з головки придатка сім'яника. Після запліднення, зиготи переносили в середовища для вирощування зигот. Зміну середовищ проводили через 48год (таблиця). В результаті оцінки ефективності використання 1-ої партії синтетичного середовища - прототипу (без гомогенату слизової матки) і дослідних партій середовищ (RPMI-1640 з додаванням різної кількості гомогенату з слизової матки ) виявлено, що із загальної кількості запліднених ооцитів: Таблиця Розвиток зигот при використанні в складі середовищ гомогенату слизової матки Стадія розвитку зиготи ЗаплідБластоцисти, шт. (% від запліднених ооцитів) Середовище культи-вування нених без зони ооцитів, шт. пізня всього Рання пел-люціда 154 7 (4,5) 2(1,3) 1 -а дослідна партія (прототип) 17(11,0) 8 (5,2) 7 (6,3) 6 (5,4) 2-а дослідна партія 110 19(17,2) 6 (5,4) 14(6,0) 43(18,4) 17(7,2) 3-а дослідна партія L 233 12(5,1) 123 7 (5,6) 8 (6,5) 7 (5,6) 4-а дослідна партія 22(17,8) - у середовищі - прототипі (без гомогенату з слизової матки) отримано 11,0% бластоцист, у тому числі 1,3% без зони пеллюціда; - у 2-й дослідній партії - синтетичному середовищі з мінімальною кількістю компонентів отримано 17,2% бластоцист, у тому числі 5,4% без зони пеллюціда. Результат свідчить про позитивний вплив гомогенату з слизової матки в складі синтетичного середовища на виживання і розвиток ембріонів, що проявлялось підвищенням на 6,2% кількості бластоцист; - у 3-й дослідній партії - синтетичному середовищі з середнім вмістом доданих компонентів отримано максимальну кількість зигот (18,4% бластоцист), у тому числі 7,2% без зони пеллюціда; 6386 - у 4-й дослідній партії - синтетичному середовищі з максимальною кількістю доданих компонентів отримано подібні до 2-ої дослідної партії результати: 17,8% бластоцист і, з них, на ранній стадії 5,6%, пізній - 6,5% і без зони пеллюціда 5,6%. Можливо збільшення кількості гомогенату слизової верхньої третьої рогу матки проявляло тенденцію до гальмування розвитку зигот. Про ефективність середовища для вирощування зигот корів ранніх стадій розвитку в складі якого були фетальна сироватка - 8-12%, еструсної сироватки корів 8-12%, клітин гранульозного шару фолікулів - 5-7млн.клітин/мл; Комп'ютерна верстка Н. Лисенко 8 інсуліну (40од/мл) - 0,25-0,35, гепарин (бтис.од.) 0,0005-0,0015 і гомогенат слизової з верхньої третини матки 8-12%. Таким чином, при порівнянні ефективності середовища для вирощування зигот корів ранніх стадій розвитку в складі якого було фетальної сироватки - 8-12%, еструсної сироватки корів 812%, клітин гранульозного шару фолікулів - 57млн.клітин/мл; інсуліну (40од/мл) - 0,25-0,35, гепарин (бтис.од.) - 0,0005-0,0015, гомогенат слизової з верхньої третини матки 8-12% отримано більше на 6,2-7,4% бластоцист ніж при використанні середовища - прототипу. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 4 2 , 01601