Спосіб серологічної діагностики інфекційного ринотрахеїту великої рогатої худоби

Изобретение относится к ветеринарии, в частности ветеринарной вирусологии и может быть использовано для серодиагностики инфекционного ринотрахеита пустулезного вульфовагинита крупного рогатого скота. Большое значение при лечении имеет своевременная точная диагностика заболевания, выявление очагов инфекции, установление типа инфицирующих вирусов. В связи с этим необходимы достаточно чувствительные и несложные способы серологической диагностики инфекционных заболеваний. Серодиагностика инфекционного ринотрахеита (ИРТ-ИПВ) крупного рогатого скота основана на выявлении специфических антител в сыворотках крови больных и переболевших животных реакцией непрямой бактериальной агглютинации с использованием бактериального антигена. Известен, например, способ серологической диагностики ИРТ-ИПВ крупного рогатого скота путем постановки реакции непрямой агглютинации с использованием антигена, полученного путем стабилизации и сенсибилизации носителя - культуры стафилококка (Авт. св. СССР № 1427830, кл. С 12 N 7/00, 1986). Общим существенным признаком известного и заявляемого технических решений является использование в качестве носителя штамма бактерий. К недостаткам способа следует отнести то, что использование живой бактерии стафилококка, имеющей собственную антигенность, приводит к искажению общей картины диагностики, снижению чувствительности способа. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ серологической диагностики ИРТ-ИПВ крупного рогатого скота путем постановки реакции непрямой агглютинации с использованием антигена, полученного в результате стабилизации и сенсибилизации носителя и нанесения на него вируса, инфекционного ринотрахеита (ТУ- 1 0.07.104-89 "Набор бактериального антигена (Б-антигена) и сывороток для диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота. - 1989). Способ выбран в качестве прототипа. Известный способ заключается в том, что готовят партию вируса через расплодку в два этапа: первый этап восстановление лиофилизированного вируса и второй этап - наработка восстановленного вируса в количестве, необходимом для заражения производственной партии бутылей со силогеным монослоем клеток. Вирус ИРТ-ИПВ далее используют для сенсибилизации стабилизированного бактериального носителя (Б-носителя). Для проведения стабилизации бактериальную суспензию штамма стафилококка формалинизируют при комнатной температуре в течение 12ч при периодическом встряхивании. После центрифугирования, отмывки и обработки теплом бактериальный носитель окрашивают генцианвиолетом. Затем Б-носитель обрабатывают танином и проводят его сенсибилизацию вирусом ИРТ-ИПВ. Для сенсибилизации формалинизированный, обработанный теплом и тонизированный Б-носитель соединяют с равным объемом вирусной суспензии с титром вируса 106,5ТЦД50мл и выше. Смесь выдерживают 40мин на водяной бане при 37°С. Сенсибилизированный Б-носитель (антиген) после центрифугирования и троекратной отмывки испытывают на специфичность и активность, после чего он пригоден для проведения реакции непрямой бактериальной агглютинации (РНБА). РНБА ставят в микротитраторе Такачи. Исследуемые сыворотки крови вводят в реакцию с антигеном, иммобилизованным на Б-носителе и по агглютинации бактерий, нагруженных вирусом ИРТ-ИПВ проводят диагностику заболевания крупного рогатого скота ИРТ-ИПВ. Общими существенными признаками известного и заявляемого способа серодиагностики ИРП-ИПВ являются: стабилизация бактерий (формалинизация); использование в качестве носителя штамма бактерий; проведение реакции агглютинации. К недостаткам известного способа следует отнести следующие: - необходимость наработки вируса ИРТ (сложная и дорогостоящая технология); - отсутствие четкого контроля за количеством вируса, сорбировавшегося на бактерии, невозможность четкой стандартизации активности антигена; - для проведения реакции непрямой агглютинации необходимо получать антиген по сложной технологии; - процесс сенсибилизации - посадки вируса на бактерию - не гарантирует качество препарата, плохо поддается контролю; - каждая отдельная серия отличается по активности, поэтому имеются трудности со стандартизацией диагностикума. В основу изобретения положена задача упрощения способа за счет исключения процесса сенсибилизации нанесения вируса на поверхность бактерий, а также обеспечение получения стандартного диагностикума для проведения реакции прямой агглютинации, упрощение технологии приготовления антигена. Поставленная задача достигается тем, что в известном способе серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота, включающем обработку бактериального штамма формалином, сенсибилизацию и постановку реакции агглютинации, согласно изобретению, обрабатывают формалином бактериальный штамм Вас. alvei ИЭКВМ УААН №413 в течение 3 - 5сут при 37 - 37,5°С, полученный бактериальный антиген сразу вводят в реакцию прямой агглютинации с сывороткой крупного рогатого скота. Бактериальный антиген, полученный путем формалинизации штамма Вас. alvei №413, не требует сенсибилизации, т.е. обработки его вирусом ИРТ-ИПВ, следовательно, нет необходимости в его наработке. Полученный диагностикум легко стандартизировать, а способ диагностики по чувствительности не уступает известным. Для осуществления способа используют штамм бактерий Вас. alvei ИЭКВМ УААН №413 (депонирован 9 февраля 1993 года №413 коллекции микроорганизмов Института экспериментальной и клинической ветеринарной медицины Украинской академии аграрных наук). Далее способ характеризуется примерами выполнения и данными проведения диагностики. Пример 1. Предварительно готовят антиген, высевая суточную культуру бактерий Вас. alvei № 413 на мясопептонный агар. Через 24ч инкубации при 37°С бактерии смывают физиологическим раствором NaCI pH 7,1 - 7,2, центрифугируют 15мин при 2 - 2,5тыс.об/мин и ресуспендируют в этом же растворе, содержащем 1% формалина, до конечной концентрации 10млрд.м.к./мл. Процесс формалинизации длится 3сут при 37°С и периодическом встряхивании. После этого культуру бактерий трижды отмывают забуференным физиологическим раствором рН 7,2 7,5 путем центрифугирования при 2 - 2,5тыс.об/мин в течение 15мин и окрашивают карболовым фуксином (из расчета на 100мл бактериальной суспензии 1мл краски) в течение 15мин при постоянном перемешивании. Избыток краски удаляют двукратной отмывкой бактерий забуференным физиологическим раствором, после чего их ресуспендируют в забуференном физрастворе, содержащем 0,5% глицерина до концентрации 40млрд.м.т./мл и консервируют мертиолятом (1:10000). После такой стабилизации бактерии сохраняют антигенную структуру, на поверхности бактерий имеются рецепторы, которые реагируют только с вирусом инфекционного ринотрахеита. Реакция специфична только по отношению к ИРТ. Реакцию бактериальной агглютинации ставят в микротитраторе Такачи. Исследуемые сыворотки крови, инактивированные при 56°С в течение 30мин, разводят физиологическим раствором. К двукратным разведениям сыворотки в объеме 0,025мл добавляют 0,025мл антигена, инкубируют 2ч при 37±1°С и 18ч при комнатной температуре. Показателем положительной реакции считают агглютинацию бактерий Вас. alvei №413 не ниже, чем на два креста при разведении сыворотки 1:8 и выше. Контроли ставят одновременно. Контроль на отсутствие спонтанной агглютинации антигена в физиологическом растворе. В 4 - 6 лунок микропанели вносят по 0,025мл физиологического раствора, затем по 0,025мл антигена. Контроль на отсутствие агглютинации антигена отрицательной (фетальной) сывороткой крупного рогатого скота. Контроль на активность антигена со специфической иммунной к вирусу ИРТ-ИПВ сывороткой крупного рогатого скота. За титр в реакции агглютинации принимают наивысшее разведение сыворотки, давшую четкую агглютинацию антигена (зонт). Учет реакции проводят только при условии четких результатов, получения антигена отсутствует, титр фетальной сыворотки - 0, титр иммунной сыворотки 1:128). Положительными считают сыворотки с титром 1:8 и выше при агглютинации не менее чем на два креста. Параллельно эти же сыворотки исследуют в реакции непрямой бактериальной агглютинации (по прототипу). При сравнительной оценке чувствительности заявляемого известного способов диагностики ИРТ-ИПВ на описанных выше примерах выявлено, что титры антител совпадают, то есть предлагаемый способ по чувствительности не уступает известному (см. таблицу). Пример 2. Для диагностики суточную культуру бактерий Вас. alvei №413 инкубируют при 37,5°С, а процесс формалинизации длится 4сут. Далее способ диагностики ведется согласно примеру 1. Пример 3. Суточную культуру бактерий инкубируют при 37,5°С, а процесс формалинизации длится 5сут. Далее диагностика проводится согласно примеру 1. Экспериментальным путем установлено, что обработка культуры бактерий. Вас. alvei №413 при более низкой, чем 37°С, и менее 3сут нецелесообразна, так как при этом замедляется процесс формалинизации. При более высокой, чем 37,5°С, температуре процесс формалинизации идетболее активно, что может обусловить такой уровень стабилизации, который не позволяет использовать бактерию по назначению. Подобный отрицательный результат имеет место и при ведении процесса формалинизации более 5сут. В таблице приведены данные проведения серологической диагностики согласно примеру 1 (№1 - 7 быки, №1 - 4 коровы), по примеру 2 (№8 - 9 быки, №5 - 6 коровы, №1 - 3 телята), по примеру 3 (№10 быки, №7 - 10 коровы, №4 - 6 телята). Исследуют парные пробы сыворотки крови от телят, коров и быков из неблагополучного по острым респираторным заболеваниям откормочного хозяйства. Кровь отбирали в начале заболевания и через 18дн. При сравнительной оценке чувствительности предлагаемого способа и способа-прототипа выявлено, что предлагаемый способ по чувствительности не уступает способу-прототипу. Таким образом, при осуществлении заявляемого способа серологической диагностики инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота достигается требуемый технический результат: - упрощение способа за счёт исключения процесса сенсибилизации - нанесения вируса на поверхность бактерии; - исключается полностью этап наработки вируса ИРТ, что существенно удешевляет процесс диагностики в целом; - способ упрощен благодаря обеспечению проведения реакции прямой агглютинации с использованием стабилизированного (формалинизированного) бактериального штамма Вас. alvei ИЭКВМ УААН №413; - только использование в качестве бактериального штамма бактерии Вас. alvei №413, стабилизированной формалином, обеспечивает проведение реакции прямой агглютинации. Таблица Результаты сравнительного серологического исследования сывороток быков, коров и телят на ИРТ-ИПВ Пример 1 2 3 4 5 6 7 8 Сыворотки Результаты исследования С известным По заявляемому диагностикумом по реакции способу, со штаммом Вас. alvei непрямой агглютинации № 413 Быки 1:1024 1:512 1:1024 1:512 1:256 1:512 1:1024 1:1024 1:512 1:512 1:512 1:1024 1:64 1:128 1:8 1:16 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 1:16 1:128 Коровы 1:256 1:64 1:512 1:256 1:64 1:256 1:64 1:32 1:32 1:128 Телята 1:64 1:128 1:128 1:32 1:128 1:32 1:16 1:128 1:256 1:128 1:512 1:256 1:64 1:256 1:64 1:32 1:32 1:128 1:64 1:128 1:128 1:32 1:128 1:32