Спосіб вирощування рослин з важкопророщуваного насіння

1. Способ выращивания растений из труднопрорастающих семян, включающий культивирование зародышей в (на) питательной среде in vitro, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что семена разрезают в плоскости их поперечного сечения без повреждения зародыша и часть семени с зародышем высаживают на питательную среду, а у сортов и видов растений с мелкими семенами оболочку семени раздавливают без повреждения или с частичным повреждением зародыша и высаживают \п vitro, при этом недоразвитые зародыши с частью оболочки семени последовательно пересаживают для дальнейшего их развития и получения из них рас-' тений на среды с разными концентрациями регуляторов роста. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что для культивирования зародышей с частью оболочки семени в питательную среду добавляют регуляторы роста в зависимости от стадии развития зародышей и осуществляют дальнейшие пересадки для получения каждой последующей стадии и в конечном итоге - растений-; для развития сердцевидных зародышей из глобулярных в среду добавляют 6-бензиламинопурин, торпедовидных зародышей из сердцевидных - бета-индолилуксусную кислоту, для формирования семядолей у торпедовидных эмбриоидов - 6-бензиламинопурин, для получения гипокотилей у проростков - гибберелловую кислоту, для развития побегов у проростков - 6-бензиламинопурин. Изобретение относится к сельскому хозяйству, а более конкретно к культивированию in vitro, выделенных из семян зародышей и может быть использовано для размножения сортов и видов растений с плохо прорастающими семенами. NO о 17919 Кроме размножения растений, одной из возможных областей использования предлагаемого способа является его применение в селекции для выращивания сеянцев из семян с недоразвитыми зародышем и эндоспермом для отбора устойчивых генотипов на уровне зародышей. Известно изобретение "Питательная среда для культивирования зародышей косточковых культур", включающее выделение из семян растений зародышей, культивирование их на питательной среде in vitro и выращивание из них растений [1]. Но выделение зародышей из семян требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном воздействии питательной среды на зародыши. Питательная среда не позволяет выращивать растения из недоразвитых зародышей, так как для различных стадий развития зародышей требуется присутствие в среде разных регуляторов роста Известен способ определения солеустойчивости растений, включающий выделение из семян растений зародышей, культивирование их на питательной среде in vitro и получение из них растений [2]. Но выделение зародышей из семян требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном контакте зародышей с питательной средой. В способе выращивают растения из семян, полученных при скрещивании различных исходных форм Но при скрещивании, например, диких видов, обладающих солеустойчивостью, с культурными сортами, которые недостаточно совместимы на биохимическом уровне, образуются труднопрорастающие семена с недоразвитыми зародышами. Для получения растений из семян с недостаточно зрелыми зародышами требуется последовательное добавление в среды разных регуляторов роста, которые будут индуцировать прохождение зародышами стадий их развития вплоть до образования побегов. Известен способ выращивания растений подсолнечника in vitro, включающий выделение из семян зародышей, культивирование их на питательной среде in vitro и выращивание из них растений [3]. Но выделение зародышей из семян способом прототипа требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном воздействии питательной среды на зародыши. В способе прототипа не изменяют последовательно состав регуляторов роста в питательной среде, что не позволяет выра 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 щивать растения из недоразвитых зародышей, находящихся на глобулярной, сердцевидной или торпедовидной стадиях развития. Кроме того, у зародышей может быть нарушен баланс эндогенных фитогормонов. Поэтому для образования семядолей у торпедовидных эмбриоидов, последующего развития гипокотилей и побегов необходимо применение питательных сред с различным содержанием экзогенных регуляторов роста. В основу изобретения поставлена задача увеличения выхода растений из зиготических зародышей, культивируемых на питательной среде in vitro и сокращения затрат труда на выращивание растений из труднопрорастающих семян. Поставленная задача решается тем, что согласно предлагаемому нами изобретению, вводится культивирование зародышей с частью оболочки семени, полученных путем поперечной разрезки семян или культивирование семян с раздавленной оболочкой без повреждения или с частичным повреждением зародыша. Необходимые затраты труда на поперечный разрез семян или частичное раздавливание их оболочки намного меньше, чем на выделение зародышей под бинокулярным микроскопом (способ прототипа). Часть оболочки семени с прилегающими к зародышу тканями защищает зародыш от резкого воздействия питательной среды, что способствует постепенной его адаптации. Питательная среда постепенно проникает к зародышу через разрез семени или в местах повреждения оболочки при раздавливании семени (в обоих случаях со стороны эндосперма), что моделирует естественный путь питания зародыша. Поэтому увеличивается процент выхода растений из высаженных зародышей. Перед высадкой на питательную среду зародыша с частью оболочки семени определяют стадию его развития в семенах различных сортов и видов растений. Недоразвитые зародыши с частями оболочек семян последовательно пересаживают для каждой следующей стадии их развития и получения из них растений на среды с разными концентрациями регуляторов роста. Для формирования сердцевидных зародышей из глобулярных в среду добавляют 6-бензиламинопурин (6-БАП), торпедовидных из сердцевидных - р-индолилуксусную кислоту (р-ИУК). Для развития семядолей у торпедовидных эмбриоидов - р-БАП. Для получения гипокотиля у торпедовидных эмбриоидов - гибберелловую кислоту (ГАЗ). Для развития 17919 побегов у проростков - 6-БАП. Зародыши с частями оболочек семян культивируют в жидкой питательной среде, что ускоряет их развитие и дает возможность легко менять состав среды (зародыши с частями оболочек семян оседают на дно культурального сосуда, питательную среду сливают и наливают новую). В случае недоразвитости эндосперма питательная среда выполняет его функции. Культивирование зародышей с частями оболочек семян, полученных за счет поперечной разрезки или частичного раздавливания семян позволяет снизить затраты труда, так как эти операции более просты и требуют меньшей квалификации сотрудников по сравнению с вычленением зародышей из семян. На фиг. 1 (а и б) схематично показан поперечный разрез семени на две части: с зародышем и без зародыша; на фиг. 2 - прорастание семядолей зародыша через поперечный разрез семени, развитие корня и побега; на фиг. 3 - развитие семядолей и гипокотиля проростков из зародышей винограда в жидкой среде; на фиг. 4 (а и б) - проростки винограда высажены на агаризованную среду для развития побегов; на фиг. 5 (а и б) развитие побегов и растений с корнями на агаризованной среде. Способ выращивания растений из труднопрорастающих семян, например, некоторых сортов винограда, которые содержат рудименты семян, или из быстро теряющих всхожесть семян полыни лимонной (Artemisia balchanorum Krasch., всхожесть через год от момента сбора приближается к 0-1%), или из труднопрорастающих семян секвойядендрона гигантского (Seguojadendron giganteum Lindl, в естественных условиях всхожесть 1-2%, в лаборатории - 10%), фисташки туполистной (Pistacia mutica Fich et May, в естественных условиях всхожесть меньше 1%, в лаборатории - 9%) осуществляют следующим образом. Семена подвергают поверхностной стерилизации. В стерильных условиях делают поперечный разрез семени (фиг. 1) на две части: на часть семени с зародышем 1 и на часть семени без зародыша 2. Поперечный разрез семени делают в такой плоскости А, которая исключает повреждение зародыша 3. Части семян 1, с находящимися в них зародышами 3, в стерильных условиях высаживают на агаризованную или в жидкую среду и культивируют in vitro до развития сеянцев (фиг. 2). Через разрез в части семени с заро 5 tO 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дышем проникает питательная среда. В случае дефектности семян из-за недоразвитости эндосперма питательная среда выполняет функции эндосперма-и способствует развитию зародышей, а в случае недоразвитости зародышей в семенах регуляторы роста, находящиеся в среде, способствуют созреванию зародышей и вызывают развитие проростков (сеянцев). У видов растений с мелкими семенами, например Artemisia balchanorum, трудно сделать поперечный разрез семени. Для таких видов может применяться раздавливание оболочки семян без повреждения или с частичным повреждением зародыша. Кроме размножения растений одной, из возможных областей использования предлагаемого способа является его применение в селекции растений. Так, например, при выведении новых бессемянных сортов винограда в ягодах образуются недоразвитые семена, которые к моменту созревания ягод атрофируются. При выведении устойчивых к милдью, оидиуму, серой гнили, филлоксере сортов винограда делают скрещивание устойчивого винограда Vitis rotundifolia, с неустойчивыми, но с хорошим качеством урожая сортами Vitis vinifera, с последующими насыщающими скрещиваниями. Однако при таких скрещиваниях образуются недоразвитые, непрорастающие семена. Из таких семян получают растения культивированием изолированных зародышей на питательной среде in vitro. Выделение зародышей - очень трудоемкий процесс, что делает массовое выращивание сеянцев практически невозможным. Предлагаемый нами способ позволяет высаживать на питательные среды большое количество зародышей с частью оболочки семени. Кроме того, оболочка семени обеспечивает постепенную адаптацию зародышей к питательной среде, что увеличивает процент их приживаемости. Частным случаем использования предлагаемого способа в селекции растений является его применение для отбора генотипов на уровне зародышей. Отрезанные части семян с зародышами, с целью отбора устойчивых генотипов к селективному фактору высаживают на среды, содержащие, например, повышенную концентрацию NaCI (coлеустойчивость), маннит (засухоустойчивость), токсины патогенов (устойчивость к грибным болезням), гербициды (устойчивость к гербицидам) и т.д. Концентрации селективных факторов подбирают путем культивирования зародышей с частями 17919 оболочек семян устойчивых сортов или отбирают единичные, развивающиеся сеянцы» генотипы которых оказались устойчивы к селективному фактору, при ингибировании прорастания большинства зародышей. При применении предлагаемого нами способа (фиг. 2) гипокотиль 4 с семядолями 5 прорастает чь юз поперечный разрез семени. Из "носика" семени вырастает корешок 6. После прорастания семядолей развивается побег 7. П р и м е р . Берут зеленые ягоды от растений винограда через 20-75 дн. после оплодотворения, моют в мыльной воде, промывают от мыльной воды. Ягоды стерилизуют 40 с 90%-ным этиловым спиртом, затем 8 мин 0,1%-ным диоцидом или 10 мин 5%-ным гипохлоритом натрия и промывают стерильной дистиллированной водой 3-4 раза на протяжении 10 мин. В стерильных условиях из ягод выделяют семена, промывают в стерильной дистиллированной роде и производят поперечный разрез семян. В случае использования вызревших семян из зрелых ягод операции по стерилизации производят непосредственно с семенами. Предварительно определяют стадии .развития Зародышей в семенах, рассматривая их под бинокулярной лупой (глобулярная, сердцевидная, торпедовидная или с развитыми семядолями). Части семян с зародышами высаживают в жидкую среду таким образом, чтобы они или по крайней мере место среза были погружены в питательную среду (фиг. 2), содержащую минеральные элементы [4], (в мг/л): 950 KNO3; 720 NH4NO3; 185 MgSO4 • 7НОО; 166 СаСЦ; 85 КН2РО4; 28 FeSCK • 7Н,О; 37 Na2 ЭДТА х х 2Н2О; 25 MnSO4 • 4Н2О; 10 3 3 10 L. .2 ZnSCX • 7Н2О; 0,25 Na2MoO4 • 2КО; 0,025 CuS04 • 5Н2О; витамины: 0,5 никотиновой кислоты, 5,5 лиридоксина-НСІ, 5,5 тиамина-НСі; 100 мезо-инозита; 20000 сахарозы; 7000 агар-агара (для агаризованной среды). рН устанавливают перед автоклавированием на значении 5, 6. В зависимости от того, на какой стадии находятся зародыши в среду добавляют необходимые для их дальнейшего развития регуляторы роста. Затем последовательно осуществляют пересадки этих зародышей с частями оболочек семчн для прохождения ими каждой последующей стадии своего развития. Глобулярные зародыши высаживают в жидкую соеду с цитокинином 6бензиламинопурином (6-БАП) в концентрации 0,5 мг/л. Образующиеся на этой среде через 10-15 дн. сердцевидные зародыши пересаживают в жидкую среду с Н В О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 8 (5-индолилуксусной кислотой ((5-ИУК) (0,1 мг/л). Формирующиеся затем через 1520 дн торпедовидные зародыши для развития семядолей помещают в жидкую среду с 6-БАП (0,5 мг/л) и культивируют при освещенности 1000-3000 лк с фотопериодом 16 ч при 25-27°С. Через 20-30 дн развиваются проростки с зелеными семядолями, гипокотилями и в нижней части с белым зачаточным корешком (фиг. 3). Проростки, развившиеся в жидкой среде, в большинстве случаев освобождаются от оболочек семян (выходят через разрезы семян) и плавают отдельно. Хотя иногда можно увидеть и проростки с частями оболочек семян (фиг. 3, на проростке, находящемся с правой стороны, сохранилась часть оболочки семени, от которой его легко можно освободить пинцетом). Далее, проростки высаживают на агаризованную среду с 0,2-0,5 мг/л 6-БАП для развития побегов (фиг. 4а). Так, у проростка, находящегося в стакане с правой стороны, начал развиваться побег (фиг. 4а). В случае слабого развития гипокотиля проростки высаживают в жидкую или на агаризованную среду с гибберелловой кислотой (ГП3) в концентрации- 0,5-2 мг/ л (ГА3 добавляют в среду перед автоклавированием) (фиг. 46), а затем пересаживают на агаризованную среду с 0,2-0,5 мг/л 6-БАП. Через 30-40 дн у проростков развиваются побеги (фиг. 5а). Побеги черенкуют на одноглазковые экспланты, содержащие лист, пазушную почку и части междоузлий с обеих сторон узла и высаживают на среду без регуляторов роста следующего состава [5], в мг/л: 308 NH4NO3; 922 KNO3; 597 MgSO4 • 7Н2О; 122 КН2РО4; 331 CaCI2; fe - хеллат по Мурасиге, Скугу [6]: 28 FeSO4 • 7Н2О; 37Na2 ЭДТА; микроэлементы по Мурасиге, Скугу (1962): 22,3 MnSO4 • 4Н О; 6,2 Н3ВО3; 8,6 ZnSO4 • 7Н2О; 0,25 Na2MoO4 • 2Н2О; 0,025 CuSO4 • 5Н2О; 0,025 CoCI2 • 6Н2О; 0,83 KJ; витамины: 20 мезо-инозита, 0,1 тиамина-НСІ, 0,2 пиридоксина-НСІ, 0,5 никотиновой кислоты; другие добавки: 1 феррулловой кислоты, 10000 сахарозы, 7000 агар-агара (для агаризованной среды). рН до автоклавирования среды - 5,6. Через 30-40 дн из одноглазковых эксплантов с листьями вырастают растения с хорошо развитой корневой системой (фиг. 56). Перед высадкой на адаптацию растения-сеянцы культивируют в объемных лабораторных сосудах (например, химических стаканах на 150 мл) с диаметром горлышка не менее 4 см. После 2-4 нед культивирования крышки из фольги заме 17919 10 няют на целлофановые (где целлофановая пленка прижата резиновым кольцом) и культивируют еще 2 - 3 нед. Через цел50 см ( Т т о В в Ы З Р е в Ш е Й л о з ы « меньше лофановую пленку происходит газообмен каіс П марте - м а е ° %ЄМЯ Р И высадке в Цу вегет и растения адаптируются к пониженной саженцы п п и ™ ° " а ц и и вырастают влажности, процессам дыхания и фотоЫ е д л я в ы с а д к и н а тоянное М е с т о Т "отсинтеза. Полученные сеянцы пересажического изучения и 0 ? Д Л Я аг Р°биологивают в теплицу и первые 2 0 - 3 0 дн их кандид а тов У в е Н Г " ^ СвЯНЦЄВ притеняют от попадания прямых солнечных лучей. При высадке растений-сеянцев виног а в теплицу в июле -'ЯЙГ»«-*~ - 10 '~ации нр ви«« схеме. "Способа выращивания Единица Показатели П р е д л а измерения способ Количество высаживания зародыша в чел/смену Приживаемость зародышей 5 0 ' Количество высаженных зародышей группой из 3-х человек в течение месяца (22 рабочих дня) Штук разрез А \ * і 1000 84±1б Эффект от применения предлагаемого способа +950 +26 17919 уроШь Фиг. г 17919 a 6 фиг 4 фиг. 5 Q Упорядник Техред М. Келемеш Коректор О. Обручар Замовлення 544 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 £ з УКРАЇНА (19) UA™ 17919 СІ ._ 03) > (51)6 А 01 Н 4/00, А 01 Н 1/04 ДЕРЖАВНЕ ПАТЕНТНЕ ВІДОМСТВО ОПИС ДО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД (54) СПОСІБ ВИРОЩУВАННЯ РОСЛИН З ВАЖКОПРОРОЩУВАНОГО НАСІННЯ (21) 95010191 (22) 11.01.95 (24) 28.02.2000 (46) 28.02.2000. Бюл. № 1 (56) 1. Авторское свидетельство СССР № 126158J, кл. А 01 Н 3/00, 1986. 2. Авторское свидетельство СССР № 1166745, кл. А 01 Н 1/04, 1985. 3. Авторское свидетельство СССР № 810160, кл. А 01 Н 1/04, 1981 (прототип). 4. Nitsch J.P., Nitsch C. Haploid plants from pollen grains // Science, 1969. V. 163. - № 3862. - P. 85-87. 5. Зленко В.А., Трошин Л.П. Соматический эмбриогенез в суспензионной культуре винограда in vitro // Цитология и генетика. - 1993. - Т. 27. - № 3. - С. 53-63. 6. Murashige Т., Skoog F.A. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. 1962. - V. 15. - P . 473-497. (72) Зленко Валерій Анатолійович, Котіков Ілля Вікторович, Трошин Леонід Петрович, Павлова Ірина Олександрівна (73) Зленко Валерій Анатолійович, Котіков Ілля Вікторович, Трошин Леонід Петрович, Павлова Ірина Олександрівна (57) 1. Способ выращивания растений из труднопрорастающих семян, включающий культивирование зародышей в (на) питательной среде in vitro, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что семена разрезают в плоскости их поперечного сечения без повреждения зародыша и часть семени с зародышем высаживают на питательную среду, а у сортов и видов растений с мелкими семенами оболочку семени раздавливают без повреждения или с частичным повреждением зародыша и высаживают \п vitro, при этом недоразвитые зародыши с частью оболочки семени последовательно пересаживают для дальнейшего их развития и получения из них рас-' тений на среды с разными концентрациями регуляторов роста. 2. Способ по п. 1, о т л и ч а ю щ и й с я тем, что для культивирования зародышей с частью оболочки семени в питательную среду добавляют регуляторы роста в зависимости от стадии развития зародышей и осуществляют дальнейшие пересадки для получения каждой последующей стадии и в конечном итоге - растений*; для развития сердцевидных зародышей из глобулярных в среду добавляют 6-бензиламинопурин, торпедовидных зародышей из сердцевидных - бета-индолилуксусную кислоту, для формирования семядолей у торпедовидных эмбриоидов - 6-бензиламинопурин, для получения гипокотилей у проростков - гибберелловую кислоту, для развития побегов у проростков - 6-бензиламинопурин. Изобретение относится к сельскому хозяйству, а более конкретно к культивированию in vitro, выделенных из семян зародышей и может быть использовано для размножения сортов и видов растений с плохо прорастающими семенами NO о 17919 Кроме размножения растений, одной из возможных областей использования предлагаемого способа является его применение в селекции для выращивания сеянцев из семян с недоразвитыми зародышем и эндоспермом для отбора устойчивых генотипов на уровне зародышей Известно изобретение "Питательная среда для культивирования зародышей косточковых культур", включающее выделение из семян растений зародышей, культивирование их на питательной среде in vitro и выращивание из них растений [1] Но выделение зародышей из семян требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном воздействии питательной среды на зародыши Питательная среда не позволяет выращивать растения из недоразвитых зародышей, так как для различных стадий развития зародышей требуется присутствие в среде разных регуляторов роста Известен способ определения солеустойчивости растений, включающий выделение из семян растений зародышей, культивирование их на питательной среде in vitro и получение из них растений [2] Но выделение зародышей из семян требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном контакте зародышей с питательной средой В способе выращивают растения из семян, полученных при скрещивании различных исходных форм Но при скрещивании, например, диких видов, обладающих солеустойчивостью, с культурными сортами, которые недостаточно совместимы на биохимическом уровне, образуются труднопрорастающие семена с недоразвитыми зародышами Для получения растений из семян с недостаточно зрелыми зародышами требуется последовательное добавление в среды разных регуляторов роста, которые будут индуцировать прохождение зародышами стадий их развития вплоть до образования побегов Известен способ выращивания растений подсолнечника in vitro, включающий выделение из семян зародышей, культивирование их на питательной среде in vitro и выращивание из них растений [3] Но выделение зародышей из семян способом прототипа требует больших затрат труда и характеризуется низким выходом растений при непосредственном воздействии питательной среды на зародыши. В способе прототипа не изменяют последовательно состав регуляторов роста в питательной среде, что не позволяет выра 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 щивать растения из недоразвитых зародышей, находящихся на глобулярной, сердцевидной или торпедовидной стадиях развития. Кроме того, у зародышей может быть нарушен баланс эндогенных фитогормонов. Поэтому для образования семядолей у торпедовидных эмбриоидов, последующего развития гипокотилей и побегов необходимо применение питательных сред с различным содержанием экзогенных регуляторов роста В основу изобретения поставлена задача увеличения выхода растений из зиготических зародышей, культивируемых на питательной среде in vitro и сокращения затрат труда на выращивание растений из труднопрорастающих семян Поставленная задача решается тем, что согласно предлагаемому нами изобретению, вводится культивирование зародышей с частью оболочки семени, полученных путем поперечной разрезки семян или культивирование семян с раздавленной оболочкой без повреждения или с частичным повреждением зародыша Необходимые затраты труда на поперечный разрез семян или частичное раздавливание их оболочки намного меньше, чем на выделение зародышей под бинокулярным микроскопом (способ прототипа) Часть оболочки семени с прилегающими к зародышу тканями защищает зародыш от резкого воздействия питательной среды, что способствует постепенной его адаптации Питательная среда постепенно проникает к зародышу через разрез семени или в местах повреждения оболочки при раздавливании семени (в обоих случаях со стороны эндосперма), что моделирует естественный путь питания зародыша Поэтому увеличивается процент выхода растений из высаженных зародышей Перед высадкой на питательную среду зародыша с частью оболочки семени определяют стадию его развития в семенах различных сортов и видов растений Недоразвитые зародыши с частями оболочек семянпоследовательно пересаживают для каждой следующей стадии их развития и получения из них растений на среды с разными концентрациями регуляторов роста. Для формирования сердцевидных зародышей из глобулярных в среду добавляют 6-бензиламинопурин (6-БАП), торпедовидных из сердцевидных - р-индолилуксусную кислоту (р-ИУК). Для развития семядолей у торпедовидных эмбриоидов - р-БАП. Для получения гипокотиля у торпедовидных эмбриоидов - гибберелловую кислоту (ГАЗ). Для развития 17919 побегов у проростков - 6-БАП. Зародыши с частями оболочек семян культивируют в жидкой питательной среде, что ускоряет их развитие и дает возможность легко менять состав среды (зародыши с частями оболочек семян оседают на дно культурального сосуда, питательную среду сливают и наливают новую). В случае недоразвитости эндосперма питательная среда выполняет его функции. Культивирование зародышей с частями оболочек семян, полученных за счет поперечной разрезки или частичного раздавливания семян позволяет снизить затраты труда, так как эти операции более просты и требуют меньшей квалификации сотрудников по сравнению с вычленением зародышей из семян. На фиг. 1 (а и б) схематично показан поперечный разрез семени на две части: с зародышем и без зародыша; на фиг. 2 - прорастание семядолей зародыша через поперечный разрез семени, развитие корня и побега; на фиг. 3 - развитие семядолей и гипокотиля проростков из зародышей винограда в жидкой среде; на фиг. 4 (а и б) - проростки винограда высажены на агаризованную среду для развития побегов; на фиг. 5 (а и б) развитие побегов и растений с корнями на агаризованной среде. Способ выращивания растений из труднопрорастающих семян, например, некоторых сортов винограда, которые содержат рудименты семян, или из быстро теряющих всхожесть семян полыни лимонной (Artemisia balchanorum Krasch., всхожесть через год от момента сбора приближается к 0-1%), или из труднопрорастающих семян секвойядендрона гигантского (Seguojadendron giganteum Lindl, в естественных условиях всхожесть 1 -2%, в лаборатории - 10%), фисташки туполистной (Pistacia mutica Fich et May, в естественных условиях всхожесть меньше 1%, в лаборатории - 9%) осуществляют следующим образом. Семена подвергают поверхностной стерилизации. В стерильных условиях делают поперечный разрез семени (фиг. 1) на две части: на часть семени с зародышем 1 и на часть семени без зародыша 2. Поперечный разрез семени делают в такой плоскости А, которая исключает повреждение зародыша 3. Части семян 1, с находящимися в них зародышами 3, в стерильных условиях высаживают на агаризованную или в жидкую среду и культивируют in vitro до развития сеянцев (фиг. 2). Через разрез в части семени с заро 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 дышем проникает питательная среда. В случае дефектности семян из-за недоразвитости эндосперма питательная среда выполняет функции эндосперма- и способствует развитию зародышей, а в случае недоразвитости зародышей в семенах регуляторы роста, находящиеся в среде, способствуют созреванию зародышей и вызывают развитие проростков (сеянцев). У видов растений с мелкими семенами, например Artemisia balchanorum, трудно сделать поперечный разрез семени. Для таких видов может применяться раздавливание оболочки семян без повреждения или с частичным повреждением зародыша. Кроме размножения растений одной, из возможных областей использования предлагаемого способа является его применение в селекции растений. Так, например, при выведении новых бессемянных сортов винограда в ягодах образуются недоразвитые семена, которые к моменту созревания ягод атрофируются. При выведении устойчивых к милдью, оидиуму, серой гнили, филлоксере сортов винограда делают скрещивание устойчивого винограда Vitis rotundifolia, с неустойчивыми, но с хорошим качеством урожая сортами Vitis vinifera, с последующими насыщающими скрещиваниями. Однако при таких скрещиваниях образуются недоразвитые, непрорастающие семена. Из таких семян получают растения культивированием изолированных зародышей на питательной среде in vitro. Выделение зародышей - очень трудоемкий процесс, что делает массовое выращивание сеянцев практически невозможным. Предлагаемый нами способ позволяет высаживать на питательные среды большое количество зародышей с частью оболочки семени. Кроме того, оболочка семени обеспечивает постепенную адаптацию зародышей к питательной среде, что увеличивает процент их приживаемости. Частным случаем использования предлагаемого способа в селекции растений является его применение для отбора генотипов на уровне зародышей. Отрезанные части семян с зародышами, с целью отбора устойчивых генотипов к селективному фактору высаживают на среды, содержащие, например, повышенную концентрацию NaCI (солеустойчивость), маннит (засухоустойчивость), токсины патогенов (устойчивость к грибным болезням), гербициды (устойчивость к гербицидам) и т.д. Концентрации селективных факторов подбирают путем культивирования зародышей с частями 7 17919 оболочек семян устойчивых сортов или отбирают единичные, развивающиеся сеянцы, генотипы которых оказались устойчивы к селективному фактору, при ингибировании прорастания большинства заро- 5 дышей. При применении предлагаемого нами способа (фиг. 2) гипокотиль 4 с семядолями 5 прорастает чь зез поперечный разрез семени. Из "носика" семени вырастает корешок 6. После прорастания 10 семядолей развивается побег 7. П р и м е р . Берут зеленые ягоды от растений винограда через 20-75 дн. после оплодотворения, моют в мыльной воде, промывают от мыльной воды. Ягоды сте- 15 рилизуют 40 с 90%-ным этиловым спиртом, затем 8 мин 0,1%-ным диоцидом или 10 мин 5%-ным гипохлоритом на т рия и промывают стерильной дистиллированной водой 3-4 раза на протяжении 10 мин. В 20 стерильных условиях из ягод выделяют семена, промывают в стерильной дистиллированной роде и производят поперечный разрез семян. В случае использования вызревших семян из зрелых ягод one- 25 рации по стерилизации производят непосредственно с семенами. Предварительно определяют стадии,развития зародышей в семенах, рассматривая их под бинокулярной лупой (глобулярная, сердце- 30 видная, торпедовидная или с развитыми семядолями). Части семян с зародышами высажива-от в жидкую среду таким образом, чтобы они или по крайней мере место среза были погружены в питательную 35 среду (фиг. 2), содержащую минеральные элементы [4], (в мг/л): 950 KNO3; 720 NH4NO3; 185 MgSO4 • 7Н2О; 166 CaCI • 85 КН2РО4; 28 FeSO4 • 7Н2О; 37 Na2 ЭДТА х х 2Н,О; 25 MnSO4 • 4Н2О; 10 Н3ВО3; 10 40 ZnS0 4 7Н2О; 0,25 Na2MoO4 • 2Н2О; 0,025 CuSCX 5Н2О; витамины: 0,5 никотиновой кислоты, 5,5 пиридоксина-НСІ, 5,5 тиамина-НСІ; 100 мезо-инозита; 20000 сахарозы; 7000 агар-агара (для агаризованной 45 среды). рН устанавливают перед автоклавированием на значении 5, 6. В зависимости от того, на какой стадии находятся зародыши в среду добавляют необходимые для их дальнейшего развития регуля- 50 торы роста. Затем поспедовательно осуществляют пересадки этих зародышей с частями оболочек семян для прохождения ими каждой последующей стадии своего развития. Глобулярные зародыши выса- 55 живают в жидкую соеду с цитокинином 6бензиламинопурином (6-БАП) в концент рации 0,5 мг/л Образующиеся на этой среде через 10-15 дн. сердцевидные зародыши пересаживают в жидкую среду с 8 р-индолилуксусной кислотой ((3-ИУК) (0,1 мг/л). Формирующиеся затем через 1520 дн торпедовидные зародыши для развития семядолей помещают в жидкую среду с 6-БАП (0,5 мг/л) и культивируют при освещенности 1000-3000 лк с фотопериодом 16 ч при 25-27°С. Через 20-30 дн развиваются проростки с зелеными семядолями, гипокотилями и в нижней части с белым зачаточным корешком (фиг. 3). Проростки, развившиеся в жидкой среде, в большинстве случаев освобождаются от оболочек семян (выходят через разрезы семян) и плавают отдельно. Хотя иногда можно увидеть и проростки с остями оболочек семян (фиг. 3, на проростке, находящемся с правой стороны, сохранилась часть оболочки семени, от которой его легко можно освободить пинцетом). Далее, проростки высаживают на агаризованную среду с 0,2-0,5 мг/л 6-БАП для развития побегов (фиг. 4а). Так, у проростка, находящегося в стакане с правой стороны, начал развиваться побег (фиг. 4а). В случае слабого развития гипокотиля проростки высаживают в жидкую или на агаризованную среду с гибберелловой кислотой (ГП3) в концентрации 0,5-2 мг/ л (ГА3 добавляют в среду перед автоклавированием) (фиг. 46), а затем пересаживают на агаризованную среду с 0,2-0,5 мг/л 6-БАП. Через 30-40 дн у проростков развиваются побеги (фиг. 5а). Побеги черенкуют на одноглазковые экспланты, содержащие лист, пазушную почку и части междоузлий с обеих сторон узла и высаживают на среду без регуляторов роста следующего состава [5], в мг/л: 308 NH4NO3; 922 KNO3; 597 MgSO4 • 7Н2О; 122 КН2РО4; 331 CaCI2; Fe - хеллат по Мурасиге, Скугу [6]: 28 FeSO4 • 7Н2О; 37Na2 ЭДТА; микроэлементы по Мурасиге, Скугу (1962): 22,3 MnSO4 • 4Н2О; 6,2 Н3ВО3; 8,6 ZnSO4 • 7Н2О; 0,25 Na2MoO4 • 2Н2О; 0,025 CuSO4 • 5Н2О; 0,025 CoCI2 - 6Н2О; 0,83 KJ; витамины: 20 мезо-инозита, 0,1 тиамина-НС!, 0,2 пиридоксина-НСІ, 0,5 никотиновой кислоты; другие добавки: 1 феррулловой кислоты, 10000 сахарозы, 7000 агар-агара (для агаризованной среды). рН до автеклавирования среды - 5,6. Через 30-40 дн из одноглазковых эксплантов с листьями вырастают растения с хорошо развитой корневой системой (фиг. 56). Перед высадкой на адаптацию растения-сеянцы культивируют в объемных лабораторных сосудах (например, химических стаканах на 150 мл) с диаметром горлышка не менее 4 см. После 2-4 нед культивирования крышки из фольги заме 10 17919 няют на целлофановые (где целлофаноженцы (длина вызревшей лозы не меньше вая пленка прижата резиновым кольцом) 50 см), в то время как при высадке в и культивируют еще 2 - 3 нед. Через целмарте - мае к концу вегетации вырастают лофановую пленку происходит газообмен саженцы, пригодные для высадки на поси растения адаптируются к пониженной тоянное место в поле для агробиологивлажности, процессам дыхания и фоточеского изучения и выделения сеянцев-, синтеза. Полученные сеянцы пересажикандидатов в новые сорта. вают в теплицу и первые 2 0 - 3 0 дн их Применение предлагаемого способа притеняют от попадания прямых солнеч(таблица) позволит значительно сократить, ных лучей. 10 затраты труда, а также увеличить выход При высадке растений-сеянцев винограстений при выращивании их из труднопрада в теплицу в июле - августе до конца рорастающих семян путем культивировавегетации не вырастают стандартные сания зародышей по вышеуказанной схеме. Технико-экономические показатели применения предлагаемого "Способа выращивания растений из труднопрорастающих семян" № п/п Единица измерения Показатели Способ протипа Предлагаемый способ Эффект от применения предлагаемого способа 1 2 3 Количество высаживания зародыша в чел/смену Приживаемость зародышей Количество высаженных зародышей группой из 3-х человек в течение месяца (22 рабочих дня) Штук 50 58±12 1000 84±16 +950 % Штук 1100 22000 +20900 разрез А _1_У % і +26 17919 питательной среды Фиг, 2 фиг. з 17919 a 6 6 Q фиг. 4 фиг. 5 Упорядник Техред М. Келемеш Коректор О. Обручар Замовлення 544 Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 +• С з