Спосіб діагностики реплікативних безсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції у жінок репродуктивного віку, вагітних і новонароджених

Спосіб відноситься до медицини, зокрема до акушерства та гінекології, інфекційних хвороб, неонатології і може бути використаний для діагностики реплікативних безсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції (ЦМВІ) у жінок репродуктивного віку, вагітних жінок та новонароджених. Європейське бюро ВООЗ віднесло ЦМВІ в список „нових і таємничих" інфекцій, що визначають майбутнє інфекційної патології. Довгий час ЦМВІ характеризувалася як опортуністична, активація якої можлива тільки в умовах первинного чи вторинного імунодефіциту [1, 5, 7, 9]. За останні роки ситуація змінюється досить динамічно. ЦМВІ виходить за межі рідкісної інфекції, перетворюючись в актуальну проблему інфектології, акушерства, перинатології [3, 6, 9]. Актуальність проблеми ЦМВІ у вагітних обумовлена тим, що дана інфекція є частою причиною акушерської патології, ембріо- і фетопатій, перинатального інфікування плода і новонародженого [2, 12, 13, 14]. Рівень інфікованості цитомегаловірусом (ЦМВ) вагітних жінок, в залежності від віку і соціально-матеріального статусу, становить 42-94% [5,7]. В той же час реальна частота вродженої ЦМВІ не перевищує 0,2-2,5% [1, 6, 14]. Пояснюється це тим, що ризик інфікування плода, тяжкість і прогноз при вродженій ЦМВІ залежать не стільки від наявності вірусу в організмі матері, скільки від активності інфекції під час вагітності. Найбільш небезпечним є первинне інфікуванні жінки ЦМВ під час вагітності. В таких випадках ЦМВІ призводить до ранніх і пізніх викиднів, загибелі плода, розвитку виродливостей, ураження ЦНС, зорового і слухового нервів, печінки, селезінки. Інфікування плода можливе не тільки при первинному зараженні матері ЦМВ під час вагітності, але і в результаті активації хронічної інфекції. Тому діагностика активної (реплікативної) ЦМВІ має принципове значення для вирішення питання про збереження вагітності і тактику ведення вагітних. Верифікація діагнозу ЦМВІ має вирішальне значення на етапі планування вагітності. Вона дозволяє скорегувати терапевтичні заходи, провести адекватну прегравідарну підготовку, яка забезпечить контроль імунної системи майбутньої матері над вірусом під час гестаційного періоду і дозволить зберегти здоров'я майбутній дитині. В практичній охороні здоров'я діагностика ЦМВІ у жінок репродуктивного віку, вагітних, новонароджених далека від досконалості. На сьогодні існує розрив між сучасними можливостями лабораторної діагностики, практичним застосуванням її методів і адекватною інтерпретацією отриманих результатів. Діагностичні можливості для розпізнання ЦМВІ в закладах рододопомоги недостатні. Діагноз ЦМВІ не може бути остаточно встановлений лише на основі клінічних даних, так як переважають безсимптомні чи субклінічні форми інфекції. Своєчасне проведення адекватної терапії може бути здійснено тільки після лабораторного підтвердження діагнозу. Однією із актуальних і неповністю вирішених проблем діагностики ЦМВІ є оцінка результатів лабораторних досліджень як критеріїв реплікативної інфекції, необхідних для правильного вибору стратегії лікування новонароджених з даною патологією, жінок під час вагітності і на етапі її планування. Згідно протоколу діагностики ЦМВІ, постановка діагнозу і встановлення клінічної форми захворювання ґрунтується на комплексному лабораторному обстеженні - визначенні противірусних антитіл методом імуноферментного аналізу (ІФА) та ДНК вірусу методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) у крові та інших біологічних рідинах [8, 10]. Аналізуючи значимість лабораторних методів діагностики ЦМВІ, дослідники роблять висновок про неінформативність серологічних методів для підтвердження активної інфекції [4, 14]. Особливістю ЦМВІ є персистенція збудника в організмі, доказом якої є наявність специфічних IgG впродовж всього життя. Тому виявлення анти-ЦМВ IgG при серологічному дослідженні не є свідченням активної інфекції. Спостереження за динамікою титрів IgG-антитіл в парних сироватках також не дозволяє однозначно інтерпретувати одержані результати. При реплікативній ЦМВІ 4-х разове наростання титрів IgG в парних сироватках спостерігається тільки у 15-20% хворих. Крім того, рівні IgG-антитіл не відображають активності інфекційного процесу - реплікативні форми ЦМВІ виявляються, як правило, у пацієнтів з їх низькими і середніми титрами. Специфічні антитіла класу IgM в певній мірі втратили роль показника активної інфекції, так як визначаються у крові після первинного інфікування впродовж 12-18 тижнів і співпадають з реплікативною фазою інфекції менше, ніж у 50% випадків. Вони можуть бути хибнопозитивними через присутність у сироватці крові ревматоїдного фактору або при реплікації одного із герпесвірусів за рахунок появи перехресних IgM. На фоні імунної недостатності у новонароджених дітей активний інфекційний процес рідко супроводжується появою специфічних IgM і підвищенням рівня IgG. Отже, специфічні антитіла - це тільки відповідь на інфекцію, а не сама інфекція. Це серологічні маркери інфікування або перенесеного захворювання. Вони не дозволяють адекватно оцінити активність інфекційного процесу, що призводить до поспішної, необгрунтованої, не завжди безпечної для вагітної і майбутньої дитини терапії. Для діагностики реплікативної форми ЦМВІ найчастіше застосовують метод ПЛР, за допомогою якого досліджують кров або інший матеріал від хворого (слину, сечу, ліквор, зішкріби із цервікального каналу) в залежності від локалізації уражень [8, 10, 14]. Однак при безсимптомному перебігу ЦМВІ, який переважає у вагітних (90%), локалізація збудника і обумовленого ним патологічного процесу в організмі невідома. Аналогічна ситуація і при внутрішньоутробній ЦМВІ, яка діагностується на підставі клінічних даних тільки у 10% новонароджених. У таких випадках для верифікації діагнозу ЦМВІ необхідно досліджувати методом ПЛР всі біологічні рідини, в яких може знаходитись вірус, що значно підвищує вартість дослідження. Крім того, метод ПЛР на сьогоднішній день є малодоступним для практичної охорони здоров'я через його дороговизну, необхідність спеціальної лабораторії, обладнаної відповідною апаратурою, підготовки кваліфікованого персоналу. Слід відмітити, що визначення ДНК ЦМВ методом ПЛР із слини, сечі, цервікального секрету не завжди свідчить в користь активної, реплікативної інфекції, оскільки пацієнти можуть виділяти вірус тривалий час після інфікування чи хвороби, будучи джерелом інфекції для оточуючих [8]. Як прототип, найближчий по технічній суті, нами вибраний метод цитологічної діагностики ЦМВІ шляхом цитоскопії осаду сечі, слини та біосубстрату із піхви і цервікального каналу у світловому мікроскопі, який базується на виявленні патогномонічних для цієї хвороби специфічних цитомегалічних клітин (ЦМК) [10, 12, 15]. Через виражений тропізм ЦМВ до епітелію вивідних протоків слинних залоз, звивистих канальців нирок, цервікального каналу його розмноження у цих клітинах супроводжується розвитком повільного цитопатичного ефекту з індукцією цитомегалічного метаморфозу і виникненням ЦМК. Вони великі за розміром (20-40мкм), мають округлу форму, велике ядро з характерними внутрішньоядерними оксифільними включеннями, оточеними оптично світлою облямівкою, що нагадують „совине око". Якщо ДНК вірусу у сечі та слині можуть виявлятися також при носійстві та хронічних персистентних формах ЦМВІ, то ЦМК - тільки у випадку активної реплікації вірусу, що робить їх абсолютним доказом реплікативної ЦМВІ при любому варіанті її перебігу, в тому числі безсимптомному, що найчастіше зустрічається у жінок репродуктивного віку, вагітних жінок та новонароджених дітей. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалити спосіб діагностики реплікативних безсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції у жінок репродуктивного віку, вагітних жінок і новонароджених дітей, в якому за рахунок додаткового дослідження забезпечується ефективна комплексна діагностика реплікативної безсимптомної цитомегаловірусної інфекції, диференціація вірусоносійства, персистентних і реплікативних її форм без додаткового інвазивного втручання, дешевим і простим у виконанні методом дослідження, доступним для лабораторії любого рівня. Поставлена задача вирішується в способі діагностики реплікативних безсимптомних форм цитомегаловірусної інфекції у жінок репродуктивного віку, вагітних жінок та новонароджених шляхом визначення антицитомегаловірусних IgG антитіл у сироватці крові серологічним методом ІФА, згідно з корисною моделлю, додатково проводять цитологічне дослідження шляхом цитоскопії осаду слини, сечі, біосубстрату із піхви і цервікального каналу, де виявляють цитомегалічні клітини, характерні тільки для даної інфекції, і, за наявності навіть однієї такої клітини у серопозитивних щодо анти-ЦМВ IgG осіб, діагностують реплікативну безсимптомну цитомегаловірусну інфекцію. Запропонований спосіб комплексної діагностики реплікативної безсимптомної цитомегаловірусної інфекції базується на даних з врахуванням наявності антицитомегаловірусних IgG антитіл у сироватці крові при серологічному обстеженні та наявності специфічних цитомегалічних клітин в осаді слини, сечі, біосубстраті із піхви і цервікального каналу, які вивчаються методом цитоскопії і дають можливість оцінити вище означені параметри захворювання. Запропонований спосіб здійснюється таким чином. Біосубстрат беруть із гігієнічного тампону, який вводять жінкам в піхву у вечірній час, а ранком витягають, поміщають у контейнер з 50мл фізіологічного розчину і негайно доставляють у лабораторію, де тампон із фізіологічним розчином переносять у центрифужні пробірки, струшуючи їх протягом 15 хвилин. Потім витягають тампон, центрифугують змив при 3000 об/хв впродовж 15хв, надосадову рідину зливають, а осад ресуспензують у 1мл фізіологічного розчину і відразу наносять на знежирене предметне скло тонким шаром. Для отримання осаду сечі та слини їх перші ранкові проби, об'ємом не менше 10мл, центрифугують при вище вказаному режимі, аналогічно ресуспензують і виготовляють мазки. Мазки висушують при температурі 18-20 градусів, фіксують в етиловому спирті або суміші Нікіфорова протягом 15-20 хвилин, забарвлюють за Романовським-Гімзою гематоксилін-еозином і вивчають під мікроскопом (об'єктив 40, окуляр 10). Результат реакції оцінюють за чотирихрестовою схемою: наявність ЦМК в препараті у великій (++++ - більше 20ЦМК), помірній (+++ - 10-20ЦМК) і малій (++,+ - до 10ЦМК) кількості. Для підтвердження ефективності способу, що заявляється, були проведені порівняльні дослідження ефективності діагностики безсимптомних реплікативних форм ЦМВІ у жінок і новонароджених методом ІФА, ПЛР та цитологічного дослідження, наведені у таблицях 1 і 2. Із представлених таблиць видно, що як у жінок, так і новонароджених відсоток позитивних результатів цитологічного дослідження любого біологічного матеріалу не відрізнявся або мав деяку тенденцію до росту у порівнянні з відсотком позитивних результатів ПЛР. Отже, у кожного пацієнта позитивні результати ПЛР співпадали з позитивними результатами цитоскопії, що свідчить про її високу діагностичну інформативність. Дані таблиць свідчать, що найбільш інформативними у жінок виявилися результати цитологічного дослідження змивів із вагінального тампону, а у новонароджених - слини. Впровадження цитологічного дослідження методом цитоскопії біологічного матеріалу у жінок репродуктивного віку, вагітних і новонароджених дозволяє з великою долею вірогідності вчасно діагностувати реплікативні безсимптомні форми ЦМВІ, призначити адекватне лікування, розробити і впровадити в практику рекомендації щодо контролю за ЦМВІ з метою профілактики її несприятливого впливу на перебіг вагітності, стан плода і новонародженого. Методика здійснення методу цитоскопії надзвичайно проста, не вимагає складних пристосувань, коштовного лабораторного обладнання, спеціальної підготовки персоналу. Цей високоспецифічний метод діагностики ЦМВІ з достатньо хорошою чутливістю є абсолютно доступним в умовах жіночої консультації, ЦРЛ, амбулаторії. Література 1. Кистенева Л.Б. Цитомегаловирусная инфекция как проблема перинатальной патологии: этиология, патогенез, диагностика // Российский вестник перинатологии и педиатрии. - 2003. - №4. - С.55-59. 2. Матейко Г.Б. Цитомегаловірусна інфекція у вагітних: особливості перебігу, ризик інфікування плода // Інфекційні хвороби. - 2004. - №4. – С.41-43. 3. Матейко Г.Б. Вплив герпетичної та цитомегаловірусної інфекції на перебіг вагітності і пологів // Галицький лікарський вісник. - 2004. - №3. - С.57-59. 4. Матейко Г.Б. Значимість серологічних і вірусологічних маркерів в діагностиці цитомегаловірусної інфекції у вагітних жінок // Вісник Вінницького національного медичного університету. - 2004. - Т.8, №2. - С.513-514. 5. Никонов А.П., Асцатурова О.Р. Цитомегаловирусная инфекция и беременность // Акушерство и гинекология. - 2003. - №1. — С.53-57. 6. Нисевич Л.Л., Бахмут Е.В., Королькова Е.Л. К вопросу о диагностике внутриутробной инфекции у новорождённых // Акуш. и гинекол.- 1998. - №3. - С. 16-20. 7. Орджоникидзе Н.В., Тютюнник В.Л. Цитомегаловирусная инфекция и беременность // Акушерство и гинекология. - 2002. - №3. - С.56-63. 8. Прилуцький О.С. Діагностика цитомегаловірусної інфекції у вагітних жінок, плода, новонароджених // Лабораторна діагностика. - 2003. - №2. – С.3-7. 9. Серов В.Н., Манухин И.Б., Кузьмин В.Н. ЦМВИ: патология беременности и плода // Акуш. и гинекол. - 1997. - №6. - С.16-20. 10. Смілянська M.B. Лабораторна діагностика цитомегаловірусної інфекції // Інфекційні хвороби. - 1998. - №2. – С.50-51. 11. Состояние и последующее развитие новорождённых детей от матерей с ЦМВИ / Веденеева Г.Н., Фоменко Б.А., Евсюкова И.И., Сельков С.А. // Росс, вестн. перинатол. и педиатрии. - 1997. - Т.42, №3. - С.25-29. 12. Спосіб діагностики цитомегаловірусної інфекції у вагітних / О.В. Гріщенко, С.В. Коровай, І.В. Полторацька, Г.А. Літкевіч / Деклараційний пат. Україна, №65390 UA, МКВ А61В10/00 (2004). 13. Тютюнник В.Л., Орджоникидзе Н.В., Зыряева H.A. Перинатальные аспекты цитомегаловирусной инфекции // Акушерство и гинекология. - 2002. - №1. - С.9-11. 14. Чаплыгина Н.М., Кицак В.Я. Современные методы диагностики врождённой вирусной инфекции // Росс, вестн. перинатол. и педиатрии. - 1996. - Т.41, №1. - С.31-36. 15. Чарный A.M. Инклюзионная цитомегалия.-М: Медицина, 1972. - 124с