Спосіб отримання еритроцитарного імуноглобулінового діагностикуму для лабораторної діагностики гарячки західного нілу

Корисна модель відноситься до галузі медицини, а саме імунології, і стосується лабораторної діагностики. Екстрена діагностика - важливий етап в системі боротьби з арбовірусними інфекціями. Реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) та гальмування непрямої гемаглютинації (РГНГА) є на сьогодні найбільш прийнятними методами діагностики цих захворювань. Вони універсальні щодо гемаглютинуючих та негемаглютинуючих арбовірусів, прості у постановці і дозволяють провести індикацію збудників протягом 1,5-2 годин [1-3]. Важливим моментом проведення вказаних реакцій є використання еритроцитарних імуноглобулінових діагностикумів (ІНЕД), спосіб отримання яких полягає у застосуванні методу сенсибілізації на фіксованих еритроцитах противірусного імуноглобуліну, де в якості гемосенситину використовується імуноглобулін, отриманий із сироваток крові лабораторних мишей, імунізованих певними штамами вірусів. Відомі кілька штамів вірусу Західного Нілу (ЗН), які використовуються для цих цілей, серед яких найбільш широко вживаним є еталонний штам Eg-101, ізольований в Єгипті [4]. Однак цей штам, володіючи певною антигенною та біологічною активністю, необхідною для штамупродуцента діагностичних препаратів, проявляє значну відмінність за фізико-хімічними та біологогічними властивостями від циркулюючих в Україні збудників гарячки Західного Нілу [5]. Недоліком штаму Eg-101 є його нижча специфічність у порівнянні із місцевими штамами, що негативно відображається на антигенній активності та результативності серологічних реакцій, які застосовуються у лабораторній діагностиці даної інфекції. Промислове виготовлення специфічних вітчизняних діагностикумів із місцевих штамів до цього часу не налагоджено. Метою корисної моделі є розробка способу отримання діагностикуму для індикації в біологічних об'єктах довкілля антигенів, циркулюючих в Україні вірусів 3Н, та виявлення антитіл у сироватках крові хворих на ЗН. Вирішення цього завдання досягається шляхом виявлення антигенів у реакції непрямої гемаглютинації та антитіл в реакції гальмування непрямої гемаглютинації із застосуванням методу сенсибілізації на фіксованих баранячих еритроцитах противірусного імуноглобуліну, де в якості гомосенситину використовується імуноглобулін, отриманий із імунної сироватки лабораторних мишей, імунізованих штамом №3266, циркулюючого в Україні, взамін еталонних штамів цього вірусу. Основними елементами запропонованої корисної моделі є накопичення вірусного матеріалу, отримання специфічного імуноглобуліну та визначення умов процесу сенсибілізації еритроцитів. Для приготування діагностикуму був використаний штам №3266 вірусу 3Н, ізольований з крові грака, відловленого в 1980 році у Херсонській області, депонований за №54 від 01.01.2002 року у колекції арбовірусів Львівського НДІ епідеміології та гігієни [6]. Шляхом пасажування був накопичений вірусвмістний матеріал (мозок інфікованих тварин з чіткою клінікою гарячки 3Н), 10% суспензія якого використовувалася для імунізації білих мишей та одержання імунної сироватки [7]. За основу приготування ІгЕД використано універсальний метод Бойдена [ 8-9 ]. Носіями високоспецифічних сенситинів використовували еритроцити барана, фіксовані формаліном за методом Вайнбаха в модифікації Батнера, а як високоактивний гемосенситин - імуноглобулін, виготовлений з імунних сироваток мишей, ріванолоетаноловим методом (РЕМ), який для порівняння і контролю титрували паралельно з імунною сироваткою в реакції зв’язування комплементу (РЗК) [10]. Концентрацію імуноглобуліну визначали спектрофотометрично, загальноприйнятим методом, при довжині хвилі 280нм., використовуючи калібрувальний графік. В подальшому спосіб проходить у кілька етапів. Приклад: Перший етап - активація еритроцитів - танізація, із концентраціями таніну 1:10000 і 1:25000 за загальновідомою схемою, і суспензуванням на фосфатному буферному розчині (ФБР) з рН - 5,8; рН -6,4; та рН 7,0. Другий етап.Три дози імуноглобуліну на ФБР (рН - 5,8; рН - 6,4; та рН -7,0) розводили починаючи з 1,0мг/мл і до 0,1мг/мл,. сенсибілізували з двома дозами ганованих еритроцитів у трьох згаданих значеннях рН при t-56°С та експозиції 30 і 60 хвилин. Суспензовані розчини еритроцитів відмивали від надлишку гемосенситину 1% розчином нормальної мишиної сироватки та ресуспензували у консервуючому розчині. Ефект сенсибілізації і встановлення оптимальної концентрації імуноглобуліну визначали в РНГА (таблиця 1). Згідно з одержаними даними оптимальними умовами процесу сенсибілізації є: рН середовища - 6,4, концентрація таніну - 1 : 10000, час процесу - 60хв., концентрація гемосенситину - 0,2мг/мл. Результати РНГА та РГНГА порівнювали з результатами реакції імуноферментного аналізу (ІФА) і РЗК (Таблиця 2, Таблиця 3). Таким чином, проведені дослідження свідчать, що запропонований спосіб дозволяє отримати вітчизняний еритроцитарний імуноглобуліновий діагностикум для лабораторної діагностики гарячки ЗН в РНГА та РГНГА, який за специфічною активністю не поступається комерційним тест-системам до ІФА та РЗК. Використання даної корисної моделі матиме важливе практичне значення для проведення індикації в біологічних об'єктах довкілля на теренах України антигенів вірусу ЗН та специфічних антитіл до нього в сироватках крові людей. Таблиця 1 Визначення оптимальних умов процесу сенсибілізац еритроцитів для приготування імуноглобулінового еритроцитарного діагностикуму до вірусу ЗН*. Час процесу рН Концентрація Д /К сенсибілізації сенсибілізації таніну 30хв. Д 1:10000 К 7,0 Д 1:25000 К 6,4 1:10000 Д Концентрація сенситину, мг/мл 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 2 4 4 4 4 4 + + + + + + 2 3 4 4 4 2 3 4 4 4 4 контролі ВСА/ ВАГС +++ 2 ++ ++--+- К Д К Д К Д К Д К Д К Д К Д К Д К Д К 1:25000 1:10000 5,8 1:25000 1:10000 7,0 1:25000 1:10000 60хв. 6,4 1:25000 1:10000 5,8 1:25000 2 + 2 + + 3 3 2 3 2 3 + 3 + 4 3 2 + 4 3 + 4 2 4 + 4 4 3 + 4 3 + 4 + 4 4 4 3 2 + 4 4 2 4 + 4 4 4 4 2 + 4 4 3 4 3 4 4 4 4 4 -+------------2++ 22+ +++ -+--------------- * Примітки: Д - мінімальна концентрація (мг/мл) імуноглобуліну (гемосенситину), яка в РНГА дала позитивний результат (++++). К - контроль специфічності з гомологічною (імунною) сироваткою. ВСА - відсутність спонтанної аглютинації. ВАГС - відсутність аглютинації з гомологічною (імунною) сироваткою. Таблиця 2 Порівняння ефективності РНГА та ІФА, як методів індикації антигенів вірусів ЗН Методи індикації Кількість суспензій комарів, обстежених на наявність антигенів - вірусів ЗН: З них-позитивні РНГА 96 4 ІФА 96 4 Таблиця 3 Порівняння ефективності РГНГА та РЗК, як методів виявлення антитіл до вірусу ЗН Методи досліджень РЗК РГНГА Кількість сироваток обстежених на наявність антитіл до вірусу ЗН: З них – позитивні (№ сироваток) 211 17 43 114 153 158 211 17 43 114 153 158 Титри антитіл 1:20 1:20 1:20 1:40 1:20 1:40 1:80 1:160 1:160 1:40 Джерела інформації 1. Коникова Р.Е.; Носков Ф.С.; Баяр Г.А. // "Реакция непрямой гемагглютинации". Труды ин-та им. Пастера Л-д., 1981. Т-56. -С. 13-44. 2. Гайдамович С.Я., Клисенко Г.А., Шапоян Н.К. // Вопр. вирусол - 1974 - №2-С. 169-172. 3. Николаев В.Г. // Вопр. вирусол.- 1975 - № 2 - С. 196-198. 4. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я./УАрбовирусы и арбовирусные инфекции. - М.: Медицина, 1989. - 335 с. 5 Етіологічна та еколого-епідеміологічна характеристика арбовірусних інфекцій в Україні. / І.А.Виноград, І.М.Лозинський, Г.В.Білецька та ін. // Вісник Сумського Державного Університету, - 2001. - № 11. - с. 41-48. 6. Позитивне рішення про видачу деклараційного патенту України на корисну модель "Штам вірусу Західного Нілу (Vims Nili Occidentalis) № 3266 для виготовлення специфічних імунобіологічних препаратів" / І.М.Лозинський, Г.В.Білецька, М.В.Шоломей та інш./ по заявці № и2005 11875 від 12.12.2005. 7. Мельникова Е. Э. // Иммунные сыворотки и асцитные жидкости к арбовирусам. Арбовирусы. - М., 1986.-С. 104-107. 8. Селиванова Я.Н., Поляков А.Н, // Технология приготовления и выпуск экспериментальных серий иммуноглобулиновых эритроцитарных политиповых диагностических препаратов к некоторым арбовирусам для РНГА.// Арбовирусы. Сборник трудов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского. - М ., 1981 - С. 145-151. 9. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. Под редакцией д. м. н. Т.В.Перадзе (СССР) и проф. Г.Халонена (Финляндия). - М., :Медицина, 1985. -300 с. 10. Арбовирусы (методы лабораторных и полевых исследований). Под ред. С-Я.Гайдамович. -М.: Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР, - 1986. -С. 140-146.