Спосіб отримання еритроцитарного імуноглобулінового діагностикуму для лабораторної діагностики кліщового енцефаліту

Корисна модель відноситься до галузі медицини, а саме імунології, і стосується лабораторної діагностики. Екстрена діагностика - важливий етап в системі боротьби з арбовірусними інфекціями. Реакції непрямої гемаглютинації (РНГА) та гальмування непрямої гемаглютинації (РГНГА) з використанням еритроцитарних імуноглобулінових діагностикумів (ІгЕД) є найбільш прийнятними методами діагностики для цих захворювань, які за чутливістю та специфічною активністю не поступаються таким високочутливим методам діагностики, як імуноферментний чи радіоімунологічний. Вони універсальні щодо гемаглютинуючих та не-гемаглютинуючих арбовірусів, прості у постановці і дозволяють провести індикацію збудників протягом 1,5-2 годин [1-3]. Сьогодні для лабораторної діагностики кліщового енцефаліту (КЕ) використовують діагностичні препарати, виготовлені із штамів, що в основному, циркулюють на теренах Російської Федерації та За хідної Європи ("Соф'їн", "Абсеттаров", "Пан", N 205 та інші) [4]. Однак ці штами за фізико-хімічними і біологічними властивостями значно відмінні від тих, які циркулюють в Україні, що позначається на їх антигенній активності [5]. У зв'язку з цим, недоліком використання діагностичних препаратів, виготовлених із згаданих штамів вірусів, є їх нижча специфічність та біологічна активність у порівнянні з антигенами із місцевих штамів, що в цілому негативно відображається на результативності серологічних реакцій для лабораторної діагностики даної інфекції. Промислове виготовлення вітчизняних специфічних діагностикумів щодо вірусу КЕ із місцевих штамів до цього часу не налагоджено. Метою корисної моделі є розробка способу отримання діагностикуму для індикації в біологічних об'єктах довкілля антигенів, циркулюючих в Україні вірусів КЕ за допомогою РНГА та виявлення антитіл у сироватках крові хворих на КЕ з допомогою РГНГА. Вирішення цього завдання досягається застосуванням методу сенсибілізації на фіксованих баранячих еритроцитах противірусного імуноглобуліну, в якості якого використовується імуноглобулін, отриманий із імунної сироватки лабораторних мишей, імунізованих штамом №2288 вірусу кліщового енцефаліту. Основними елементами запропонованої корисної моделі є накопичення вірусного матеріалу, отримання специфічного імуноглобуліну та визначення умов процесу сенсибілізації еритроцитів. Для приготування діагностикуму був використаний штам №2288 вірусу КЕ, виділений з кліщів Ixodes ricinus, зібраних у В.Березнянському районі Закарпатської області [6]. Шляхом пасажування на лабораторних мишах був накопичений вірусвмістний матеріал (мозок інфікованих тварин з чіткою клінікою КЕ), 10% суспензія якого використовувалася для імунізації білих мишей та одержання імунної сироватки [7]. За основу приготування ІгЕД використано універсальний метод Бойдена.[8-9]. Носіями високоспецифічних сенситинів використовували еритроцитів барана, фіксованих формаліном за методом Вайнбаха в модифікації Батнера, а як високоактивний гемосенситин - імуноглобулін, виготовлений з імунних сироваток мишей ріванолоетаноловим методом (РЕМ), який для порівняння і контролю титрували паралельно з імунною сироваткою в реакції звязування комплементу (РЗК) [10]. Титр імуноглобуліну - 1:640, імунної сироватки - 1:80. Концентрацію імуноглобуліну визначали спектрофотометрично загальноприйнятим методом, при довжині хвилі 280нм., використовуючи калібрувальний графік. В подальшому спосіб проходить у кілька етапів Перший етап - активація еритроцитів - танізація, із концентраціями таніну 1:10000 і 1:25000 за загальновідомою схемою, і суспензуванням на фосфатному буферному розчині (ФБР) з рН - 5,8; рН - 6,4; та рН - 7,0. Другий етап. Три дози імуноглобуліну на ФБР (рН - 5,8; рН - 6,4; та рН - 7,0) розводили, починаючи з 1,0мг/мл, і до 0,1мг/мл. сенсибілізували з двома дозами танованих еритроцитів у трьох згаданих значеннях рН при t-56°С та експозиції 30 і 60 хвилин. Суспензовані розчини еритроцитів відмивали від надлишку гемосенситину 1% розчином нормальної мишиної сироватки та ресуспензували у консервуючому розчині. Ефект сенсибілізації і встановлення оптимальної концентрації імуноглобуліну визначали в РНГА (таблиця 1). Згідно з одержаними даними оптимальними умовами процесу сенсибілізації є: рН середовища - 6,4, концентрація таніну - 1:25000, час процесу - 30хв, концентрація гемосенситину - 0,2мг/мл. Результати РНГА та РГНГА порівнювали з результатами реакції імуноферментного аналізу (ІФА) і РЗК (Таблиця 2, Таблиця 3). Таким чином, проведені дослідження свідчать, що запропонований спосіб дозволяє отримати вітчизняний еритроцитарний імуноглобуліновий діагностикум для лабораторної діагностики КЕ в РНГА та РГНГА, який за специфічною активністю не поступається комерційним тест-системам до ІФА та РЗК. Використання даної корисної моделі матиме важливе практичне значення для проведення індикації в біологічних об'єктах довкілля на теренах України антигенів вірусу КЕ та специфічних антитіл до нього в сироватках крові людей і тварин. Таблиця 1 Визначення оптимальних умов процесу сенсибілізації еритроцитів для приготування імуноглобулінового еритроцитарного діагностикуму до вірусу КЕ*. Час процесу рН Концентрація сенсибілізації сенсибілізації таніну 30 хв. 1:10000 7,0 1:25000 1:10000 6,4 1:25000 5,8 1:10000 Д/К Д К Д К Д К Д К Д Концентрація сенситину,мг/мл 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 2 4 4 4 4 4 + + + + + + 2 3 4 4 4 2 3 4 4 4 4 + + 2 3 4 4 4 4 + 2 3 3 4 4 контролі ВСА/ВАГС +++ 2 ++ ++--+ ++ -++ ------ 1:25000 1:10000 7,0 1:25000 1:10000 6,4 60 хв. 1:25000 1:10000 5,8 1:25000 К Д К Д К Д К Д К Д К Д К Д К 2 + + 3 3 2 3 + 3 + 4 3 2 + + 4 2 4 + 4 4 3 + + 4 + 4 4 4 3 2 2 4 + 4 4 4 4 2 3 4 3 4 4 4 4 4 ------2++ 22+ +++ -++++ +++ - ++ --+ -------- * Примітки: Д - мінімальна концентрація (мг/мл) імуноглобуліну (гемосенситину), яка в РНГА дала позитивний результат (++++). К - контроль специфічності з гомологічною (імунною) строваткою. ВСА - відсутність спонтанної аглютинації. ВАГС - відсутність аглютинації з гомологічною (імунною) сироваткою. Таблиця 2 Порівняння ефективності РНГА та ІФА, як методів індикації антигенів вірусів КЕ Методи індикації Кількість суспензій кліщів, обстежених на наявність антигенів вірусів КЕ: 3 них-позитивні РНГА ІФА 90 90 7 7 Таблиця 3 Порівняння ефективності РГНГА та РЗК, як методів виявлення антитіл до вірусу КЕ Методи досліджень Кількість сироваток обстежених на наявність антитіл до вірусу КЕ: РЗК 136 РГНГА 136 3 НИХ- ПОЗИТИВНІ(№ сироваток) 23 25 40 43 58 76 23 25 40 43 58 76 Титри антитіл 1:40 1:40 1:160 1:80 1:20 1 160 1 160 1 320 1 160 1:80 1:40 Джерела інформації 1. Коникова Р.Е.; Носков Ф.С.; Баяр Г.А. // "Реакция непрямой гемагглютинации". Труды ин-та им. Пастера Л-д., 1981. Т-56. - С. 13-44. 2. Гайдамович С.Я., Клисенко Г.А., Шапоян Н.К. // Вопр. вир усол. - 1974 -№2-С. 169-172. 3. Николаев В.Г. // Вопр. вир усол.- 1975 - № 2 - С. 196-198. 4. Львов Д.К., Клименко С.М., Гайдамович С.Я. // Арбовирусы и арбовирусные инфекции. - М.: Медицина, 1989. - 335 с. 5 Етіологічна та еколого-епідеміологічна характеристика арбовірусних інфекцій в Україні. / І.А.Виноград, І.М.Лозинський, Г.В.Білецька та ін. // Вісник Сумського Державного Університету, - 2001. - № 11. - с. 41-48. 6. Пат. 63096 А України, МПК С 12 N 7/00. Штам вірусу кліщового енцефаліту Flavi virus encephalitidem ixodicum № 2288 для виготовлення специфічних імунобіологічних препаратів Л.М.Лозинський, Г.В.Білецька, М.М.Козловський, Є.Г.Рогочий // - Опуб. 15.01.2004. Бюл. №1. 7. Мельникова Е. Э. // Иммунные сыворотки и асцитные жидкости к арбовирусам. Арбовирусы. - М., 1986.-С. 104-107. 8. Селиванова Я.Н., Поляков А.Н. // Те хнология приготовления и выпуск экспериментальных серий иммуноглобулиновых эритроцитарных политиповых диагностических препаратов к некоторым арбовирусам для РИГА.// Арбовирусы. Сборник трудов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского. - М ., 1981 - С. 145-151. 9. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. Под редакцией д.м.н. Т.В.Перадзе (СССР) и проф. Г.Халонена (Финляндия). -М., :Медицина, 1985. -300 с. 10. Арбовирусы (методы лабораторных и полевых исследований). Под ред. С.Я.Гайдамович. -М.: Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского АМН СССР,- 1986.-С. 140-146.