Спосіб виготовлення природного гама-інтерферону людини

Спосіб виготовлення природного гама-інтерферону людини, який включає культивування клітин-продуцентів - опленоцитів здорових людей в 28899 при дозі БЛ 10 мкг/мл титри були вдвічі і втричі вищими. Характерно, що збільшення дози БЛ до 20 мкг/мл не давало істотного підвищення виходу кінцевого продукту при щільності спленоцитів від 5·106 до 1·107 в 1 мл. В попередніх дослідах було знайдено, що вихід g-ІФНу залежить також від ступеню очистки індуктора біосинтезу. Ось чому в наступній серії дослідів було взято три види БЛ - неочищеного, напівочищеного та очищеного, використаних в однаковій концентрації - 20 мкг/мл при щільності клітин 5·106 в 1 мл. Виявилось (табл. 3), що через 36 год. біосинтезу максимальні титри людського g-IФH спостерігали при індукції його неочищеним лектином, значно менше - на 30% - напівочищеним і майже наполовину менша - очищеним препаратом лектину. Наведені дані свідчать, що найбільш активним індуктором g-ІФН-генезу (суперіндуктором) є лектин Вас. subtilis 668, особливо в неочищеному вигляді, оскільки такий стан зумовлює його існування у вигляді мономера. Лектин же після очистки приймає димерну, а, можливо, і тримерну форми, які менш активно індукують синтез g-ІФН. Подальші процедури по отриманню природного g-ІФНу людини здійснюються за "класичною" схемою виготовлення всіх природних ІФНів: після видалення спленоцитів та їх залишків центрифугуванням проводять стерилізуючу фільтрацію, стерильний розлив у флакони чи ампули, визначення антивірусної активності в МО по відношенню до ВВС, а також перевірка препаратів на відповідність ТУ. В залежності від бажання споживача препарат виготовляють в рідкому чи ліофілізованому стані. Із наведених матеріалів видно, що: 1. Оптимальні умови біосинтезу при виробництві людського g-ІФН створюються в запропонованому реакторі чи скляному посуді об'ємом від 35 до 50 л, в якому забезпечується постійне значення перемішування клітинної суспензії, постійна аерація СО2, постійне значення температури в межах 37,0-37,5°С та рН 7,2-7,4, що є гарантом біосинтетичної активності спленоцитів при суспензійному культивуванні, зменшення травмування та деструкції клітин. 2. Найбільш високий вихід природного g-ІФН людини досягається при культивуванні спленоцитів людини із щільністю клітин 1·106-5·106 в 1 мл та індукції неочищеним бактерійним лектином в концентрації 10-20 мкг/мл. 3. Схема виготовлення природного g-ІФН людини включає такі етапи: отримання суспензії спленоцитів із селезінки здорових людей, праймінг, біосинтез препарату, видалення спленоцитів та їх залишків, стерилізуюча фільтрація, визначення антивірусної активності, розлив і визначення відповідності препарату ТУ, фасування та відправка споживачеві. Розроблена біотехнологія дає можливість отримувати природний g-ІФН людини, ціна якого в десятки разів нижча від такої для препаратів імпортного виробництва. Аналіз спеціальної літератури та патентних матеріалів не виявив аналогів описаної біотехнології та препаратів природних g-ІФНів людини. хійних лихах, тощо. Ці вперше внесені в технологію нововведення мають безперечну перевагу порівняно з "класичними" способами отримання природного людського g-ІФНу, оскільки з однієї селезінки вагою 200 г отримують таку кількість імуноцитів, як з крові 50-150 донорів, з якої необхідно вилучати лише лімфоцити. Адже відомо, що тільки лімфоцити, клітини природних кілерів та спленоцити є повноцінними продуцентами g-ІФНу. Для праймінгу використовують гомологічний ІФН (природний чи рекомбінантний) в дозі 100 МО на 1 мл клітинної суспензії. Як індуктор g-ІФН-генезу використовують бактерійний лектин (БЛ) Bac. subtilis 668 при концентрації 10-20 мкг/мл суспензії клітин. Вказаний лектин має високу g-ІФН-генну активність, що дозволяє отримувати препарати g-ІФН з високою антивірусною дією - 20484096 МО/мл. Його отримання, порівняно з лектинами рослинного походження, порівняно дешева процедура, а сам лектин нешкідливий для організму і порівняно мало токсичний - всього 89 мг/мл ваги теплокровних тварин при трьох способах введення. Показано також, що пул синтезованого ІФНу містить понад 90% g-ІФН, решта - a-ІФН. Питання про можливість використання цього лектину для отримання природного g-ІФН людини, його дози, а також щільність суспензії спленоцитів досліджували в спеціальних дослідах, результати яких ілюструються нижченаведеними прикладами. Слід зазначити лише, що ці попередні лабораторні досліди здійснювали в міні-реакторах із скла об'ємом 1,0 і 3,0 л, хоча для отримання експериментальних серій препарату використовують спеціальні скляні пульсаційні реактори фірми Applicon (Нідерланди) об'ємом від 35 до 50 л чи аналогічні формою скляні посудини кулеподібної форми з пласким дном, в яких при постійному перемішуванні, поверхневій аерації СО2 та спеціальним буфером забезпечували постійну температуру 37,0-37,5°С та pH в межах 7,2-7,4. Для з'ясування питання, який із лектинів, що звичайно використовують для біосинтезу природного g-ІФНу, КонА, ФГА, трави "Золотий дощ", а також запропонований нами лектин Вас. subtilis 668, є найбільш придатним, було проведено спеціальні досліди, результати яких наведено в табл. 1. Як було встановлено, при однаковій щільності спленоцитів - 5·106 клітин в 1 мл - максимальні титри g-ІФН через 4 і 24 год. давали КонА і БЛ, дещо нижчими були ці показники для ФГА та трави "Золотий дощ". В зв'язку з цим наступні експерименти проводили тільки з КонА та БЛ. Було доведено, що максимальні вихідні титри g-ІФНу в обох випадках було зареєстровано через 18-36 год. біосинтезу. Наступні досліди дали можливість встановити, що вихід кінцевого продукту біосинтезу залежить як від щільності суспензії спленоцитів, так і концентрації індуктора біосинтезу - БЛ. Було показано, зокрема (табл. 2), що, порівняно з КонА, БЛ має більш виражені g-ІФН-генні потенції. Адже навіть при оптимальній дозі КонА давав максимальні титри (1:1024) лише при щільності клітин 1·107 в 1 мл, тоді як БЛ уже при дозі 5 мкг/мл давав такі ж титри при щільності клітин 1·106-5·106 в 1 мл, а 2 28899 Джерела інформації 1. Кишко Я.Г., Спивак Н.Я., Карась О.Я. и др. "Способ получения гамма-интерферона сельскохозяйственных животных". А.с. СРСР № 1561273, 1990 г. 2. Кішко Я.Г. "Спосіб виготовлення гамаінтерферону та пристрій для його здійснення". Патент України № 8276 А від 26.03.1996 р. Таблиця 1 Ефективність біосинтезу g-ІФН спленоцитами людини під впливом різноманітних лектинів Лектини КонА ФГА Трави "Золотий дощ" Вас. subtilis 668 20 960 820 930 940 Кількість інтерферону в супернатанті, МО/мл Час індукції (год.) і доза лектинів (мкг/мл) 4 год. 24 год. 50 20 910 1020 800 940 910 910 930 1200 50 1100 1010 970 1300 Таблиця 2 Залежність титрів людського g-ІФНу від щільності суспензії спленоцитів та дози індуктора (БЛ) Доза лектину, мкг/мл 50,0 5,0 10,0 20,0 Щільність спленоцитів в 1 мл суспензії КонА 1·106 5·106 1·107 Вас. Subtilis 1·106 5·106 1·107 1·106 5·106 1·107 1·106 5·106 1·107 Середній титр g-ІФНу, МО/мл 420 640 1024 1040 1040 980 1040 1040 980 2048 3560 3012 Таблиця 3 Синтез природного людського g-ІФН після індукції БЛ різного ступеню очистки Антивірусна активність g-ІФН, МО/мл (середнє значення 5 дослідів) 3020 2300 1530 Бактерійний лектин Неочищений Напівочищений Очищений __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 34 прим. Зам._______ __________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 __________________________________________________________ 3