Спосіб отримання флуоресціюючого антирабічного гама-глобуліну

Спосіб отримання флуоресціюючого антирабічного гама-глобуліну, що виділяють з високоактивної моноспецифічної, антирабічної сироватки крові, який включає висолювання за допомогою насиченого розчину сульфату амонію, діаліз для вилучення заливок сульфату амонію, мічення гама-глобуліну флуорохромом, який відрізняється тим, що до сироватки, з титром антитіл проти вірусу сказу 1:640 ... 1:1280, отриманої з крові коней відібраної з яремної вени додають рівний об'єм насиченого розчину сульфату амонію з рН 7,2, суміш витримують 18 годин; осад глобуліну центрифугують при 2000 об/хв протягом 0,5 години, зливають надосадову рідину, а до преципітату додають фосфатно-буферний розчин (ФБР) з рН 7,4 в об'ємі рівному половині початкового об'єму сироватки і ресуспендують преципітат, вимірюють загальний A (54) СПОСІБ ОТРИМАННЯ ФЛУОРЕСЦІЮЮЧОГО АНТИРАБІЧНОГО ГАМА-ГЛОБУЛІНУ 30910 об'єм і додають рівну кількість охолодженого насиченого розчину сульфа ту амонію, через годину суспензію центрифугують при 5000 об/хв протягом 0,5 години; осад ресуспендують в 0,01М фосфатно-буферним розчином в об'ємі, рівному 1:2 початкового об'єму сироватки; осад глобулінів відокремлюють і діалізують проти ФБР протягом 2...4 діб на магнітному змішувачі, при цьому діалізуючу рідину змінюють двічі на добу, діаліз продовжують до повної відсутності слідів сульфа ту амонію у ФБР; визначають концентрацію білка по біуретовій реакції і доводять концентрацію глобулінів до 2%; в об'ємі рівному 0,1 загального об'єму суміші використовують карбонатно-бікарбонатний буфер (КББ) з рН 9,0, додають 0,03 мг флуоресцеіна ізотіоцитату (ФІТЦ) на 1 мг білку суміш перемішують на магнітному змішувачі протягом 18...20 годин; після кон'югації преципітат, який може утворитися, вилучають центрифугуванням; вилучають флуоро хром, що не зв'язався з антитілами фільтрацією через колонку з сефадексом G-50, при цьому всі наведені процеси проводять при температурі 4 С, профільтрований кон'югант розливають по 1 мл в стерильні флакони місткістю 10 куб. см. і піддають ліофільному сушінню та ук упорці. Приклад 1.1. Для отримання антирабічної сироватки проводять гіперімунізацію коней вакцинними штамами вірусу сказу. Перед забором крові у гіперімунізованих коней визначають наявність антитіл проти сказу та їх ти тр в реакціі нейтралізації на білих мишах. Титр антитіл проти вірусу сказу у таких тварин повинен бути на рівні 1:640 ... 1:1280. Якщо титр антитіл у сироватці крові буде нижчий 1:640, то кров від таких тварин не відбирають, а коней з низьким рівнем антитіл піддають додатковій імунізації до отримання бажаного титру антитіл до вірусу сказу. 1.2. Від коней, з високим рівнем антитіл до вірусу сказу, відбирають кров із яремної вени в стерильний посуд. Із крові отримують сироватку, яку зразу ж використовують для приготування антирабічного гама-глобуліну. 2. Отримання антирабічного гама-глобуліну із гіперімунної сироватки 2.1. Осадження глобулінів сульфатом амонію Глобулінову фракцію відокремлюють від інших білків сироватки насиченням її сульфатом амонію. Для цього спочатку вимірюють загальний об'єм сироватки і додають рівний об'єм насиченого розчину сульфа ту амонію з рН 7,2. Суміш залишають на 18 годин при температурі 4°С. Осад глобуліну, що утворився, центрифугують при 2000 об./хв. протягом 30 хвилин при температурі 4°С. Після центрифугування надосадова рідина повинна бути прозорою, а осад преципітату щільним. Надосадову рідину зливають, а до преципітату додають фосфатно-буферний розчин (ФБР) з рН 7,4, в об'ємі, рівному половині початкового об'єму сироватки і ретельно преципітат ресуспендують. Вимірюють загальний об'єм і додають рівну кількість охоло дженого насиченого розчину сульфату амонію. Через годину суспензію центрифугують при 5000 об/хв протягом 30 хвилин при температурі 4°С. Осад ресуспендують в 0,01М ФБР в об'ємі, рівному 1:2 початкового об'єму сироватки. Осад глобулінів переносять в целофановий мішечок і діалізують проти ФБР протягом 2-4 діб при температурі 4°С на магнітній мішалці. Діалізуючу рідину необхідно змінювати двічі на добу. Діаліз продовжують до тих пір, поки не залишиться ніяких слідів у ФБР сульфату амонію. Наявність сульфату амонію в діалізуючому розчині визначають шляхом внесення декількох капель 10%-го розчину хлориду барію в пробірку з діалізуючим розчином. Наявність помутніння розчину вказує на присутність солей сульфату амонію. 2.2. З'єднання глобулінів з флуоресцеіна ізотіоцианатом (ФІТЦ) 2.2.1. Визначення концентрації білку та з'єднання глобулінів з ФІТЦ Спочатку визначають концентрацію білка по біуретовій реакції. Глобуліни повинні бути в концентрації 2,0%. Для розчинення ФІТЦ та утворення оптимальних умов для з'єднання флуорохрому з білком антитіл використовують карбонатно-бікарбонатний буфер (КББ) з рН 9,0, в об'ємі рівному 0,1 загального об'єму суміші, а потім додають 0,03 мг ФІТЦ на 1 мг білка. Суміш перемішують на магнітній мішалці протягом 18-20 годин при температурі 4°С. 2.2.2. Очи щення кон'югату Після кон'югації (з'єднання глобулінів з флуорохромом) преципітат, який може утворитися, вилучають центрифугуванням. Для вилучення із міченого гама-глобуліну флуорохрому, що не зв'язався з антитілами використовують метод фільтрації через колонку з сефадексом G-50, який проводять у слідуючому порядку. Скляну колонку (300´15 мм) закріплюють у вертикальному положенні. На кожні 10 мл кон'югованих глобулінів необхідна колонка з сефадексовим гелем розміром не менше 150´15 мм. В кожну колонку вносять збалансований 0,01М ФБР гельсефадекс, якому дають відстоятися декілька годин, поки шар гелю не стане рівномірно щільним. Промивають колонку 0,01М ФБР (рН 7,2), не допускаючи висихання геля. Кон'югат обережно переносять в колонку піпеткою, так щоб не порушити поверхні геля сефадекса. Після того як кон'югат повністю пройде гель, додають декілька мілілітрів 0,01М ФБР. По мірі проникнення його в гель додають нові порції до повного проходження кон'югату через колонку. Кон'югат розділяється на дві фракції оранжевого кольору. Збирають всю першу фракцію, яка швидко досягає нижнього кінця колонки, до тих пір, поки забарвлення не стане менш інтенсивним. Профільтрований кон'югат розливають по 1 мл в стерильні флакони місткістю 10,0 куб. см. і піддають ліофільному висушуванню та укупорці. 2 30910 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3