Спосіб одержання антирабічного імуноглобуліну

Способ получения антирабического иммуноглобулина путем внутримышечного введения концентрированной культуральной антирабической вакцины КОКАВ донорам с последующим выделением целевого продукта из плазмы крови, отличающий с я тем, что вакцину вводят донорам О (і), и А (И) групп крови в объеме 1,0 мл на 0, 7, 15, 30 сутки, выделенную из плазмы крови гамма-глобулиновую фракцию отстаивают, подвергают диафильтрации на плоскорамных фильтрах, заправленных полиамидными мембранами на подложке типа УПМ-И и полученный целевой продукт лиофилизируют. С > Изобретение относится к области медицины, а именно к производственной трансфузиологии, и предназначено для получения высокоэффективного длительно сохраняющегося антирабического иммуноглобулина для профилактики и лечения гидрофобии. Известны способы получения иммуноглобулинов направленного действия: антистафилококкового, противогриппозного, противостолбнячного, противосинегнойного и др. Известны также способы получения антирабического иммуноглобулина. В основе этих способов лежит иммунизация соответствующими антигенами и выделение иммуноглобулина из плазмы крови. Наиболее близким к заявляемому техническому решению является "Способ получения антирабического иммуноглобулиьа человека" [1]. Данным способом предусмотрено внутримышечное введение донорам концентрированной культуральной антира бической вакцины (КОКАВ) из вирусного штамма Внуково 32-107, в дозе 1,5 мл на 1,, 30, 90 сутки. Способ позволяет получить аллогенный антирабический иммуноглобулин с титром вируснейтрализующих антител 1:2430-1:7290. Упомянутое техническое решение имеет следующие недостатки: - длительность интервалов между вве дениями вакцины, практически неприемле мая для донорства; - большой разброс титров вируснейтра лизующих антител (В HAT) в сыворотке крови вакцинируемых, в связи с отсутствием целе направленного подбора контингента доно ров, что в свою очередь приводит к получению препарата с нестандартным диа пазоном титров в различных сериях; - получение препарата в жидкой лекар ственной форме (в виде 10% раствора), что сокращает срок его хранения, создает неу ел ел О J 11155 добство при транспортировке в очаги эпизоотии Задачей изобретения является повышение специфической активности, стабильности и удлинение сроков хранения 5 аллогенного антирабического иммуноглобулина для внутримышечного введения. Это достигается целенаправленным подбором доноров для иммунизации КОКАВ, относящихся к О (I). A (II) группам крови 10 по системе АВО, специально отработанной схемой иммунизации, выделением у-глобулиновой фракции из плазмы крови с послед ующей ее очисткой методом диафильтрации на плоскорамных фильтрах, 15 заправленных полиамидными мембранами на подложке типа УПМ II, и лиофилизацией препарата на конечном этапе. Признаками настоящего изобретения являются: 20 - подбор доноров О (I) и А (II) групп крови для иммунизации высокореагирующих на введение антирабической вакцины. Резуль таты наблюдений свидетельствуют о значи тельно более низком уровне 25 специфического иммунного ответа доноров В (III) и АВ (IV) групп крови; - отбор плазмы крови доноров с высо ким содержанием вируснейтрализующих антител. Титр ВНАТ определяется в парал- 30 лельных исследованиях реакции нейтрали зации на белых беспородных мышах и в иммуноэнзиматическом тесте; - очистка у -глуболиновой фракции ме тодом диафильтрации на плоскорамных 35 фильтрах с полиамидными мембранами на подложке типа УПМ-Н. Совокупность указанных отличительных признаков дала возможность разработать способ получения аллогенного антирабиче- 40 ского иммуноглобулина в лиофизилирован-ном виде с высоким титром ВНАТ. Сущность изобретения характеризуется конкретными примерами исполнения. 45 П р и м е р 1. Донор И. Группа крови О (I). Введение концентрированной культуральной антирабической вакцины в количестве 1,0 мл про- 50 водят с соблюдением строгих правил асептики и антисептики в верхний наружный квадрант ягодицы на 0, 7, 15, 30 сутки. На 45 сутки в сыворотке крови донора определяют титр ВНАТ в реакции нейтрализации 55 на белых беспородных мышах и в иммуноэнзиматическом тесте. Результат определения: 1:810. Плазму крови, изъятую методом плазмафереза, фракционируют спиртовым способом в соответствии с действующим регламентом производства 10—16% раствора гамма-глобулина из донорской плазмы. Фракционирование иммунной антирабической донорской плазмы проводили по методу Кона в соответствии с регламентом производства раствора гамма-глобулина из донорской плазмы.Для этого осадок белков фракции ІІ+ІЦ, содержащий гамма-глобулиновую фракцию, выделяют в соответствии с регламентом производства 5,10, 20% альбумина. Затем проводят переосаждение белков фракции II+III. Осадок фракции II+III, хранившийся не более 3-х месяцев при температуре не выше -20°С, растворяют в предварительно охлажденном до 0° физиологическом растворе из расчета 7,5 объемов физиологического раствора по отношению к весу осадка. Суспензию загружают в стеклянный сосуд, помещенный в фракционный стол, при температуре спирта большой ванны - 1±1°. Суспензию при постоянном помешивании охлаждают до 0° и перемешивают при этой температуре еще два часа Затем температуру спирта большой ванны фракционного стола понижают до -5 - -6°. Суспензию охлаждают до температуры -1°. В мерник медленно заливают предварительно охлажденный до -15 - -20°С 95% этиловый спирт в количестве 240 мл на 1 литр суспензии. Конечная концентрация спирта в смеси 19%. Смесь перемешивают не менее 2-х часов при температуре -5 - -6°С (созревание осадка) Затем осадок отделяют центрифугированием в стаканчиковых рефрижераторных центрифугах при температуре -5 - -6°С и 2700-3000 об/мин в течение 30 минут. Осадок собирают в закрытую емкость и взвешивают; хранят при температуре -35 - -50°С не более одного месяца. Получение осадка гамма-глобулина. Центрифугат загружают в стеклянный сосуд, помещенный во фракционный стол при температуре спирта большой ванны -5 -6°С. К раствору добавляют 5 М раствор хлористого натрия из расчета 10 мл на каждый литр центрифугата, устанавливают рН 7,07,2 путем добавления 4,2% раствора бикарбоната натрия. Затем из мерника добавляют охлажденный до температуры -15 —20°С 95% этиловый спирт из расчета 160 мл на 1 литр смеси. Конечная концентрация спирта в смеси 26%. Затем смесь перемешивают не менее 2-х часов, центрифугируют при температуре -5 - -6°С, 2700 - 3000 об/мин в течение 30 минут и выделяют фракцию II (осадок В). 11155 Выделенную фракцию II (осадок В) суспендируют в охлажденном 0,9% растворе поваренной соли в соотношении вес/объем 1:2. Концентрация белка в суспензии составляет 5,0-5,5%. Смесь оставляют на длитель- 5 ное время (до двух месяцев) для отстаивания. По истечении этого времени отстоявшуюся жидкость пропускают через мезгу и осветленный раствор подвергают диафильтрации, которую проводят на пло- 10 скорамных фильтрах, заправленных полиамидными мембранами на подложке типа УПМ II. Продолжительность очистки 10 литров 5% раствора гамма-глобулина на этой уста- 15 новке составляет 4 часа. Очищенный от низкомолекулярных примесей раствор пропускают через стерилизующие фильтры и разливают в ампулы для лиофилизации. П р и м е р 2. 20 Донор П. Группа крови А (И). КОКАВ вводили в дозе 1,0 мл по схеме 0,7,15, 30 сутки. На 45 сутки определяли титр В HAT. Результат определения - титр ВНАТ 1:516. Иммуноглобулин получали аналогичным 25 способом. П р и м е р 3. Донор С, Группа крови В (III). КОКАВ вводили в дозе 1,0 мл по схеме 0, 7, 15 30 сутки. На 45 сутки определяли титр ВНАТ. 30 Результат определения - титр ВНАТ 1:30. Плазма не пригодна для получения антирабического иммуноглобулина. П р и м е р 4. Донор К. Группа крови АВ (IV). Проведе- 35 на внутримышечная иммунизация КОКАВ в дозе 1,0 мл по схеме 0, 7, 15, 30 сутки. На 45 сутки определяли титр ВНАТ. Результат определения - титр ВНАТ 1:45,5. Плазма не пригодна для получения антирабического 40 иммуноглобулина. (Распределение уровня ВНАТ с учетом групповой принадлежности сывороток крови представлено в таблице 1). Целевой продукт, полученный в лиофилизированном виде, характеризуется тит- 45 ром ВНАТ 1:54000. Таким образом, согласно изобретению, разработан способ получения лиофизилированного аллогенного антирабического иммуноглобулина с титром вируснейтрали- 50 зующих антител не менее чем 1:50000. Сухой препарат антирабического иммуноглобулина выпускается в запаянных ампулах и представляет собой таблетку или порошок кремоватого цвета. Предлагаемый способ 55 позволяет получить быстрорастворимый антирабический иммуноглобулин, который хранится при 18-22°С и не требует специ альных условий при транспортировке в оча ги эпизоотии, не подвергается фрагментации в процессе хранения, безвре ден для организма и пригоден для внутри мышечного введения. Сухой иммуноглобулин термостабилен (выдержи вает после растворения прогрев при 57° в течение 4 часов), не имеет остаточного спир та, что также исключает денатурацию белка при хранении. Воспроизведение способа доступно для производства препаратов крови в условиях заводов бакпрепаратов, станций переливания крови; производство экономически оправдано, не требует специального оборудования. Данный препарат крайне необходим для практического здравоохранения. Стабильность препарата. Лиофилизированный аллогенный антирабический иммуноглобулин после двух лет хранения при температуре +16 - +22°С сохранял исходную специфическую активность и физико-химические свойства. Срок годности препарата определяли также при хранении препарата в течение 1 месяца при температуре +37°С. Данный метод применяется для изучения стабильности иммунных препаратов различной направленности и предусматривает, что условия хранения в течение 3 лет при температуре +2 — 10°С равны 1 году при температуре +18 - +22°С и равноценны хранению 1 месяц при температуре +37°С. Результаты исследований свидетельствуют о сохранении специфической активности антирабического донорского иммуноглобулина в титре 1:31180 после хранения при температуре 37°С 1 месяц, что соответствует442 ME. В тоже время известно, что коммерческие препараты донорского иммуноглобулина, применяемые за рубежом с лечебной и профилактической целью, имеют специфическую активность 150 ME. Таким образом, целевой продукт полностью пригоден к применению в результате двух лет хранения при температуре +16 +22°С и последующего хранения при температуре +37°С 1 месяц, что в общей сложности соответствует трем годам хранения при температуре +16 - +22°С или, примерно, девяти годам хранения при температуре +4°С. И155 Распределение уровней В HAT в сыворотке крови доноров, иммунизированных КОКАВ с учетом их групповой принадлежности Группа крови п Среднегеометриче Рх ские уровни ВНАТ (М ±т) 0(0 31 485,9±144,8 А(Н) B(iii) AB(IV) 38 20 11 213,9±86,2 41,4±18,3 45,5±16,7 >0,05