Спосіб визначення параметрів зв’язування нейроактивних амінокислот

Спосіб визначення параметрів зв'язування нейроактивних амінокислот, який включає отримання синаптосом, інкубацію медіатору з суспензією синаптосом, візуалізацію кількості зв'язаного лігарду, який відрізняється тим, що візуалізацію виконують за допомогою флюоресцентного зонду, добавленого в інкубаційне середовище, отримані результати порівнюють з аналогічними для середовища інкубації без медіатору і константу дісоціації (Кд) визначають за методом зворотних координат як величину, зворотню константі зв'язування (Кс), що є відрізком на осі абсцис, який відтинає пряма залежності | гашення флуоресценції зонду (F/F0-F) від величини, зворотній концентрації медіатору у середовищі (1/а), де: F0 - флуоресценція зонду в інкубаційному середовищі без медіатору; F - флуоресценція зонду у присутності медіатору; 1/а - величина, зворотна концентрації медіатору у розчині; а максимальну кількість місць зв'язування (Вмакс) визначають за формулою: Винахід відноситься до біохімії, а саме до вивчення властивостей нейроактивних амінокислот, і може бути використаний для оцінки функціональної активності системи збуджуючих амінокислот. Загальноприйнятими параметрами зв'язування для медіаторів є: константа дисоціації (Кд) та максимальна кількість ; місць зв'язування (Вмакс). Визначення параметрів зв'язування норадреналіну на модельній фосфоліпідній мембрані. Взаємодію норадреналіну на модельній фосфоліпідній мембрані вивчають за допомогою флюоресцентних зондів. Інкубаційна суміш складається із: 3метоксибензантрону (МБА, 5 мкМ), суспензії ліпосом (0,4 мг ліпіда/мл) та медіатору. Результати порівнюються з інкубаційним середовищем без медіатору. Кс визначають за методом зворотних координат як величину, зворотну константі зв'язування (Кс): Кд=1/Кс. Для визначення кількості місць зв'язування проводять вимірювання при двох різних концент раціях мембран (N1 та N2) та однаковій концентрації медіатору (А). З формули: Кс+1/А-r2= Кс*i1/i2+1/(А-r2*і1/i2*1/q), де q=N2/N1, І0-І/I=i, r1/r2= і1/і2*1/q, І0-інтенсивність флюоресцеінції у відсутності медіатору, І - інтенсивність флюоресценції у присутності медіатору, А - концентрація медіатору у середовищі, r - концентрація зв'язаного з мембраною медіатору, знаходять r2. А з рівняння r/C(N-r)=Kc, де N - кількість місць зв'язування, С - концентрація медіатора, не зв'язаного з мембраною, знаходять кількість місць зв'язування (Григорьева Е.К., Добрецов Г.Е. Взаимодействие нонахлозйна и норадреналина на модельной фосфолипидной мембране // Бюл. экспер. биол. и мед. – 1976. - № 9. - С. 1084-1086.) Визначення параметрів зв'язування 3H-L-глутомату радіолігандним методом. Мембрани (50 мкг білка) інкубують з 10-200 нМ 3 H-L-глутамату (45 Кі/ммоль) в 10 мМ трисцитратному буфері (рН=7,4) 15 хвилин при температурі 37°С. Зв'язаний ліганд відділяють від не (19) UA (11) 33927 (13) де а - концентрація медіатору у розчині, r - концентрація медіатору, зв'язаного з мембранами; с концентрація білка; при цьому r знаходять з рівняння: , (F × F ) × F 1 1 = Kc × 0 1 2 + Kc + (F0 × F2 ) × F1 A - r × (F0 × F1 ) × F2 × N1 A - r2 2 (F0 × F2 ) × F1 N 2 де F1 та F2 - флуоресценція зонду при двох різних концентраціях мембран та однаковій концентрації медіатору; N1/N2 - співвідношення концентрацій мембран; А - вміст медіатору у середовищі інкубації, r2 -концентрація зв'язаного з мембранами медіатору при концентрації мембран N2. A Bmax ù é r + rú ê( a - r ) × Kc û, =ë c 33927 трації медіатору; N1/N2 - співвідношення концентрацій мембран; А - вміст медіатору у середовищі інкубації; r2 -концентрація зв'язаного з мембранами медіатору при концентрації мембран N2 (Григорьева Е.К., Добрецов Г.Е. Взаимодействие нонахлозина и норадреналина на модельной фосфолипидной мембране // Бюл. экспер. биол. и мед. – 1976. - № 9. - С. 1084-1086). Винахід пояснюється графіком. На фіг. зображено графік по визначенню константи зв'язування (Кс) за методом зворотних координат. Кс є відрізком на осі абсцис, який відтинає пряма залежності гашення флуоресценції зонду (F/F0-F) від величини, зворотній концентрації медіатору у середовищі (1/а), де: F0 - флуоресценція зонду в інкубаційному середовищі без медіатору; F - флуоресценція зонду у присутності медіатору; 1/а - величина, зворотна концентрації медіатору у розчині. Спосіб виконують наступним способом: Суспензію синаптосом (20 мкл, 20-40 мкг білка) інкубують з 50-300 нМ глутамату (або іншої нейроактивної амінокислоти) в присутності флюоресцентного зонду (3-метоксибензантрону - МБА або 1-феніламіно-8-сульфонафталіну - АНС) у 50 мМ трис-НСІ буфері (рН=7,4) 15 хвилин при температурі 37°С. Одна з проб містить білка у 2 рази більше, ніж інші. Після інкубації вимірюють інтенсивність флюоресценції проб на спектрофлуориметрі "Хітачі" MPF-4, для МБА l=450/535, для АНС l=3961Ш. Результати порівнюють з інтенсивністю флуоресценції зонду у середовищі без медіатору. За даними флюоресценції вилічують Кд та Bмакс. Виконання способу ілюструє наступний приклад: Визначення Кд та Вмакс глутамату з мембранами синаптосом стовбура щурів (зонд МБА) F0=147. Флюоресценція МБА при різних концентраціях глутамату: 50 нМ- 138; 100 нМ-132; 200 нМ-130; 300 нМ-126. Флюоресценція МБА при двох концентраціях мембран: 20 мкл суспензії синаптосом - F1=130 (F0=147); 40 мкл суспензії синаптосом - F2=132 (F0=153). Згідно графіку (фіг. 1): Кс=7,7-106, тому Кд=130 нмоль. Виходячи з інтенсивності флуоресценції МБА при різній концентрації мембран та однаковій концентрації медіатору та визначеної Кс, з рівняння: (F × F ) × F 1 1 Kc + = Kc × 0 1 2 + A - r2 (F0 × F2 ) × F1 A - r × (F0 × F1 ) × F2 × N1 2 (F0 × F2 ) × F1 N2 -14 r2=4*10 , вміст білку у пробі становить 40 мкг, тому Вмаx=1,64 пмоль/мг білку. зв'язаного фільтруванням скрізь мембранні фільтри (Синпор, ЧССР, діаметр пор 0,6 мкм). Фільтри промивають 2,5 мл холодного буферу. Неспецифічне зв'язування визначають у присутності неміченого L-глутамату. Фільтри висушують, розчиняють у стандартній сцинтиляційній суміші, що містить метилцеллозольв, і визначають радиактивність на лічильнику "Nuclear Chicago" (США). Константу зв'язування (Кс) та максимальну кількість місць зв'язування проводять з використанням графіків Скетчарда, де r - концентрація комплексу ліганд/рецептор (пмоль/мг]); r/с - відношення концентрації зв'язаного комплексу до концентрації вільного ліганду (фмоль/(нмоль/мг)). Кд=1/Кс. (Дамбинова С.А., Городинский А.И. Связывание 3H-L-глутамата с синаптическими мембранами, выделенными из коры больших полушарий и гиппокампа крыс линии Крушинского-Молодкиной // Бюл. экспер. биол. и мед. - 1982. - № 12. - С.5859). Вищевказаний спосіб параметрів зв'язування нейроактивних амінокислот є найбільш близьким по досягнутим результатам до того, що заявляється, тому ми обрали його прототипом. Основним недоліком прототипу є громіздкість виконання способу. В основу винаходу покладено задачу спрощення способу визначення параметрів зв'язування нейроактивних амінокислот. Задача, яка покладена в основу винаходу, вирішується тим, що у відомому способі, який включає отримання синаптосом, інкубацію медіатору з суспензією синаптосом, згідно з винаходом візуалізацію кількості зв'язаного ліганду виконують за допомогою флуоресцентного зонду, який добавляється в інкубаційне середовище. Отримані результати порівнюють з даними для середовища інкубації без медіатору. Це дозволяє запобігти процедури відділення зв'язаного ліганду від незв'язаного, а це, в свою чергу, дозволяє визначити зв'язування у разі швидко дісоціюючих систем рецептор-ліганд. Константу дісоціації (Кд) визначають за методом зворотних координат як величину, зворотню константі зв'язування (Кс), а максимальну кількість місць зв'язування (Вмакс) визначають за формулою: Bmax ù é r + rú ê( ë a - r) × Kc û, = c де а - концентрація медіатору у розчині, r концентрація медіатору, зв'язаного з мембранами; с - концентрація білка; при цьому г знаходять з рівняння: , (F × F ) × F 1 1 Kc + = Kc × 0 1 2 + A - r2 (F0 × F2 ) × F1 A - r × (F0 × F1 ) × F2 × N1 2 (F0 × F2 ) × F1 N2 де F1 та F2 - флуоресценція зонду при двох різних концентраціях мембран та однаковій концен 2 33927 Фіг. ____________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 3