Спосіб отримання модифікованих целюлозних мембран

Спосіб отримання целюлозних мембран шляхом модифікування їх поверхні, який відрізняється тим, що мембрани витримують у водному розчині перйодату натрію NaJO4 концентрацією 0,1 М протягом 1 год. та проводять іммобілізацію білка (поліпептид нізин або фермент лізоцим) з концентрацією від 0,1 до 2,0 мг/мл протягом 2 год. (11) (21) u200808104 (22) 13.06.2008 (24) 10.11.2008 (46) 10.11.2008, Бюл.№ 21, 2008 р. (72) КОНОВАЛОВА ВІКТОРІЯ ВАЛЕРІЇВН А, U A, ВАКУЛЮК ПОЛІНА ВАСИЛІВНА, UA, БУРБАН АН АТОЛІЙ ФЛАВІАНОВИЧ, U A (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ "КИЄВОМОГИЛЯНСЬКА АКАДЕМІЯ", UA 3 37001 4 Для реалізації процесу модифікування, який Zoom) та обробляли у програмі Adobe Photoshop ґрунтується на активуванні (окисненні) целюлози 7.0 (табл. 2). перйодатом натрію NaJO4, як початковий матеріал Бактерицидну активність отриманих мембран використовували пористі промислові целюлозні визначали шляхом фільтрування через досліджумембрани Nadir C030F (Німеччина). Для окисненвану мембрану суспензії клітин штаму Escherichia ня целюлози в діальдегідцелюлозу використовуcoli HB 101, яку готували у стерильному фізіологівали водний розчин перйодату натрію NaJO4 кончному розчині NaCl. Культур у бактерій, що виросцентрацією 0,1М. (білий порошок з молекулярною ла на діагностично-диференційному середовищі масою 213,89; густина d20 = 3860кг/м3, використоЕндо (Fluka, США), вносили у фізіологічний розчин вували без додаткової перекристалізації (Aldrich)). NaCl до кінцевої концентрації 1×106 клітин/мл. ПісАктивацію поверхні проводили протягом 1 год при ля розведення до концентрації 1×103 клітин/л, 10мл температурі 55°С. Після чого на окиснені мембрасуспензії відфільтровували через досліджувану ни проводять іммобілізацію білка (поліпептид нізін мембрану до сухого залишку. Контролем слугува(Fluka) з молекулярною масою 3 354 або фермент ла мембрана за прототипом, тобто не модифіколізоцим (Fluka) з молекулярною масою 14 600) з вана. Фільтрацію проводили в установці непроточконцентрацією від 0,1 до 2,0мг/мл при температурі ного типу Amicon 8200 (Millipore Corporation, США) від 20±5°С та рН розчину = 8.3. Тривалість модиз використанням термостатування і перемішуванфікування 2год. Після модифікування мембрани ня об’ємом 0,18дм 3 і площею мембрани 26,4×104 2 відмивали в дистильованій воді протягом години і м . Робочий тиск становив 0,05МПа. Робоча темвикористовували для подальших досліджень. пература 25°С. Після фільтрації мембрану інкубуВсі показники отриманих целюлозних мембран вали на щільному діагностично-диференційному представлені в таблиці 1-3. В таблицях наведено: середовищі Ендо за температури 32°С протягом приклад І - поліпептид нізин, доби. Бактерицидну активність визначали за кільприклад II - фермент лізоцим. кістю колонієутворювальних одиниць (КУО), що Концентрацію білку визначали спектрофотовиросли на отриманій мембрані. Та виражали у метрично на СФ-46 при довжині хвилі 280нм. рН відсотках щодо кількості КОУ, що виросли на порозчину вимірювали за допомогою рН-метра. Кільверхні мембрани за прототипом. кість білка, іммобілізованого на мембрані визначаЯк видно з табл. 1 кількість білка іммобілізовали за різницею концентрацій модифікуючого розного на см 2 мембрани залежить від його початкочину до та після іммобілізації (табл. 1). вої концентрації в розчині модифікування. Гідрофільність одержаних мембран вивчали, вимірюванням краєвих кутів змочування її поверхні водою методом сидячої краплі. Краєві кути змочування поверхні мембрани вимірювали за допомогою цифрової фотокамери (Olympus C-765 Ultra Таблиця 1 Залежність кількості білка (m, мг/см 2), іммобілізованого на целюлозній мембрані від початкової концентрації розчину модифікування (С, мг/мл) приклад І приклад II С, мг/мл m, мг/см 2 m, мг/см 2 0,1 0,008 0,009 0,2 0,016 0,018 При збільшенні концентрації від 0,1 до 0,4мг/мл кількість прищепленого ферменту збільшується несуттєво від 0,08 до 0,022мг/см 2. Суттєве зростання кількості ферменту, іммобілізованого на мембрані, до 0,092-0,1мг/см 2 спостерігається для концентрації модифікуючого розчину 0,081,0мг/мл (табл 1). При подальшому збільшенні концентрації модифікуючого розчину до 2мг/мл кількість прищепленого на мембрані білка не змінюється. А отже, для модифікування целюлозної мембрани оптимальною є концентрація 1мг/мл. Були досліджені бактерицидні властивості мембран модифікованих антимікробними агентами 0,4 0,022 0,025 0,6 0,052 0,067 0,8 0,092 0,10 1,0 0,100 0,11 2,0 0,100 0,11 білкового походження. В якості об’єктів дослідження використовували нізін та лізоцим. Нізін - це природний антимікробний поліпепдид, що виробляється деякими штамами Lactococcus lactis, інгібує ріст широго спектру грам-позитивних бактерій та має статус GRAS (визнаний безпечним). Лізоцим - фермент класу гідролаз; антибактеріальній фермент, що руйн ує стінку бактеріальної клітини, в результаті чого відбувається її розчинення (лізис). В організмі грає роль неспецифічного антибактеріального барьеру, особливо в містах контакту з зовнішнім середовищем (сльози, слюна, слизова оболонка носа). 5 37001 6 Таблиця 2 Характеристики мембран Гідрофільність Кут змочування, ° 5±2 5±2 30±2 Приклад І Приклад II Мембрана за прототипом Як свідчать дані табл. 2, модифіковані мембрани з іммобілізованим білком лізоцимом (приклад II) або нізином (приклад І) проявляють бактерицидну активність на відміну від мембрани за прототипом. Бактерицидна активність мембран, модифікованих лізоцимом (приклад II) значно вища ніж мембрани з іммобілізованим нізіном (приклад І) і становить 98%. Також отримані мембрани Бактерицидність, % 72±5 98,2±2 0 Неспецифічна сорбція до БСА 0,003±0,001 0,002±0,001 0,050±0,001 характеризуються значно вищою гідрофільністю поверхні ніж мембрана за прототипом. На отриманих мембранах спостерігається майже відсутність неспецифічної сорбції до БСА (бичачий сиворотковий альбумін) тоді як на мембрані за прототипом вона в 25 разів вища. Таблиця 3 Бактерицидність та продуктивність отриманих мембран залежно від терміну їх експлуатації Термін експлуатації, діб 0 1 2 5 10 20 Приклад І Б, % 72 72 72 72 68 56 Jv, л/м 2год 321,5 318,0 301,8 291,6 286,3 254,3 Як видно з даних табл. 3 мембрани з іммобілізованим нізіном (приклад І) забезпечують стабільну бактерицидну дію протягом 5 діб експлуатації, при цьому їх продуктивність знижується на 6%. Мембрани з іммобілізованим лізоцимом (приклад II) мають значно вищу початкову бактерицидну активність, яка зберігається протягом більш тривалого терміну експлуатації, а саме 20 діб. Падіння продуктивності (приклад II) за цей період також менше ніж для мембран отриманої за прототипом. Тоді як мембрани отримані за прототипом бактерицидних властивостей не виявляють, що приводить до зниження терміну їх експлуатації. Целюлозні мембрани одержані запропонованим способом забезпечують: - бактерицидні властивості; - зниження адсорбції білкових молекул; - підвищену гідрофільність поверхні; - подовження терміну експлуатації мембран шляхом зменшення їх біологічного забруднення продуктами життєдіяльності мікроорганізмів. Комп’ютерна в ерстка Г. Паяльніков Приклад II Б,% 98 98 98 98 98 95 Jv, л/м 2год 301,2 298,3 298,1 297,2 290,3 280,4 Мембрана за прототипом Б, % 0 0 0 0 0 0 Jv, л/м 2год 298,6 220,1 211,3 195,6 189,3 172,5 Джерела: 1. P. Valettea, M. Thomas,a P. Dejardin. Adsorption of low molecular weight proteins to hemodialysis membranes: experimental results and simulations// Biomaterials - 1999. - V.20, N17. - P.1621-1634. 2. Kormoczi GF, Rosenkranz AR, Zlabinger GJ. Polymorphonuclear granulocyte stimulation by cellulose-based hemodialysis membranes// Clin Chem Lab Med. - 1999. - V.37, N3. - P.351-355. 3. Ward RA, McLeish KR. Hemodialysis with cellulose membranes primes the neutrophil oxidative burst// Artif Organs. - 1995. - V.I9 N8. - P.801-807. 4. Yoshihiko Abe, Akira Mochizuki. Hemodialysis membrane prepared from cellulose/Nmethylmorpholine-N-oxide solution. III. The relationship between the drying condition of the membrane and its permeation behavior// J. Appl. Polym. Sci.. 2003. 89, №6, с.1671-1681. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601