Спосіб депротеїнізації розчинів

Спосіб депротеїнізації розчинів шляхом додавання до них ацетонітрилу, який відрізняється тим, що після додавання ацетонітрилу та видалення осаду додають такий органічний розчинник, щоб коефіцієнт розподілу ацетонітрилу між водою та цим розчинником наближався до нуля, після чого суміш рідин після ретельного перемішування розділяють на водний депротеїнізований шар та шар органічних розчинників. В.Ш. (13) 41118 (11) UA Осадження білків розчинами кислот ве де до значного зниження рН розчину, підвищен ня його іонної сили, призводить до деякого збільшення об'єму. Осадження білків додаванням органічних розчинників збільшує об'єм розчина у кілька разів, що у відповідному відношенні знижує чутливість методу визначення. Осадження білків органічними розчинниками є не зовсім кількісним: за наявності гемоглобіна розчин одержують з деяким забарвленням. Усунення цього потребує переекстрагування (2 додаткових операції), не завжди можливо, збільшує час виконання аналізу, збільшує втрати речовини, що виз начається. Найбільш близьким за сукупністю ознак до винаходу є метод видалення білків з біологічної рідини, який набув поширення в останні десятиріччя, особливо для подальшого ви користання проб в рідинно-хроматографічному аналізі, а саме з використанням ацетонітрилу [Comparison of Cytochrome P-450-Dependent Metabolism and Drug Interactions of the 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Reductase Inhibitors Lovastatin and Pravastatin in the Liver / W.Jacobsen, G.Kirchner, K.Hallensleben at al. // Drug Metab Dispos.-1999.- Feb; 27(2), P. 173-179]. Недоліками цього методу є значне розведення проби органічним розчинником, а також некількісне видалення білків з розчину. Суть ви находу При використанні методу-прототи пу до 1 мл біологічної рідини (сироватки або плазми крові) додають 3 мл ацетонітрилу, та після ретельного перемішуван ня осад видаляють центрифугуванням. Але при цьому не досягається повного видалення (19) Винахід відноситься до аналітичної хі мії, а саме до підготовки біологічних зразків до дослідження. Рівень техніки При визначенні ряду речовин у біологічних рідинах заважаючим фактором є присутність білка, який здатний впливати на точність визначення. Традиційними методами видалення білків з сироватки або плазми крові є їх обробка розчинами солей важких металів (р туті, свин цю, урану), осадження гідрооксидами (гідроксиди цинку, міді, заліза), мінеральними кислотами (азотна, метафосфорна), вольфраматом натрію, молібденовою кислотою, фосфо вольфраматом натрію, фосфомолібдатом натрію, органічними кислотами (трихлороцтова, оцтова, пікрінова, сульфосаліцілова), органічними розчинниками (метанол, етанол, ацетон) [Биохимические методы исследования в клинике.- Под ред. А.А.Покровского .- Медицина, М.: 1969.- 652 с.]. Відомі методи видалення білків додаванням перхлорної кислоти з подальшим усуненням перхлорату осадженням у вигляді калійної солі. Всі ці методи характеризуються низкою недоліків, а саме - після їх здійснення розчин, що залишається, збільшується в об'ємі, що знижує чутливість метода, також в розчині з'являються додаткові іони або молекули, наявність яких може негативно впливати на подальше визначення у розчині речовин. Найбільш придатним є метод із застосуванням солянокислого ацетону [Там же, стор. 91], але він потребує занадто багато часу, а внаслідок його застосування у концентраті залишається значна кількість домішок. А ____________________ 41118 білків - части на їх залишається в надосадовій рідині. При введенні такої рідини до хроматографічної колонки, остання може бути пошкоджена - білкові молекули здатні незворотньо осідати в колонці унеможливлюючи проходження елюенту з необхідною швидкістю при достатньо низькому тиску. Крім того, об'єм рідини збільшуєть ся вчетверо, що у відповідну кількість разів зменшує концентрацію речовин, присутніх у біологічній рідині. Це зменшує чутливість хроматографічного визначення у обробленої таким чином біологічної рідини. В основу ви находу поставлено задачу поліпшити повноту осадження білків з біологічної проби, не збільшуючи при цьому об'єм рідини, яка залишається після такого осадження, а саме шляхом додаткової обробки, націленої на видалення остаточної кількості білків та ацетонітрилу, яким проводилася первинна обробка проби, забезпечити практичну відсутність білків та ацетонітрилу в пробі, призначеної для подальшого аналізу. Для вирішення цієї задачі пробу після осадження части ни білків за допомогою ацетонітрилу додатково обробляють органічним розчинником, здатним видалити ацетонітрил з водного середовища (наприклад хлороформ, діхлорметан, тетрахлорід вуглецю, диетиловий ефір, бензол та ін.) та центрифугують. При цьому в інтерфазі осад жуються залишкові кількості білка, а ацетонітрил повністю переходить у шар органічного розчинника. На поверхні залишається шар водного розчину, якій містить во дорозчинні компоненти біологічної рідини практично у вихідних концентраціях. Відомості, які підтверджують можливість здійснення винаходу До 1 мл сироватки або плазми крові додають 3 мл ацетонітрилу. Суміш ретельно перемішується стряхуванням протягом 30-60 секунд. С уміш центрифугують при 1000-1500 об/хв протягом 10-20 хви лин. Рідина зливається у чисту пробірку, к уди до неї додається 10 мл хлороформу. Після ретельного стряхуван ня протягом 30-60 секунд суміш центрифугують при 1500 об/хв протягом 15-30 хви лин. Після цього вміст пробірки розділяється на 3 шари: нижній - суміш хло роформа з ацетонітрилом, середній - інтерфаза, утворена залишковою кількістю білків, верхній - водний, об'єм якого не перевищує 0,9 мл. У водному ша рі практично відсутні білкові молекули, але концентрація гідрофільних речовин, які не екстрагуються у хлороформ, практично не відрізняється від їх початкової концентрації у сироватці (плазмі). Тираж 50 екз. Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101 (03122) 3 – 72 – 89 (03122) 2 – 57 – 03 2 41118 3