Спосіб виготовлення вакцини інактивованої проти пневмоентеритів поросят, спричинених умовно патогенною мікрофлорою

Спосіб виготовлення вакцини інактивованої проти пневмоентеритів поросят, спричинених умо 3 Недоліком даного методу є відносно висока реактогенність, токсичність та низька імуногенність через використання 0,5 % водного розчину формаліну в якості інактиватору. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити процес одержання і контролю мало реактогенної і високо ефективної інактивованої вакцини проти пневмоентеритів поросят. Задача корисної моделі вирішується тим, що девіталізацію виробничих культур ешерихій, псевдомонасів, клібсієл та стрептококів проводять за допомогою 0,3 % водного розчину перекису водню та 0,1 % водного розчину формальдегіду, з наступною інкубацією одержаної суміші при 37,0-38,0 °С протягом 15 годин. Спосіб виконується таким чином: 1) Проводять бактеріологічні дослідження біологічного матеріалу від загиблих поросят з ознаками шлунково-кишкових, респіраторних або респіраторно-кишкових уражень для виділення збудників захворювання; 2) 3 метою ідентифікації та визначення біологічних властивостей досліджують ізольовані культури умовно патогенних бактерій і виявляють у них ознаки патогенності (визначення ЛД50 в тесті летальності для білих мишей); 3) На підставі одержаних даних проводять відбір і селекцію мікроорганізмів із високим патогенним потенціалом; 4) Проводять культивування відібраних мікроорганізмів з метою накопичення біомаси; 5) Виготовлюють корпускулярний антиген, який інактивують за допомогою 0,3 % розчину перекису водню та 0,1 % водного розчину формальдегіду при експозиції 15 годин; 6) Вносять до корпускулярного інактивованого антигену ад'ювант (6 % завис аеросилу на 0,9 % розчині натрію хлориду); 7) Складають серію вакцини, фасують, укупорюють, закатують, етикетують; 8) Проводять контроль вакцини; 9) Забезпечують пакування, транспортування, зберігання готового препарату. Порівняльний аналіз з відомими технічними рішеннями в галузі ветеринарної мікробіології та біотехнології дозволяє зробити висновок, що в основі виготовлення вакцини інактивованої проти пневмоентеритів поросят використовуються протективні перекисно-формолінові антигени збудників, що відповідає критеріям «новизна» та «суттєві ознаки». Приклад 1. Виробничі штами умовно патогенних бактерій. З метою виготовлення вакцини інактивованої проти пневмоентеритів поросят спричинених умовно патогенною мікрофлорою використовували епізоотичні штами бактерій, а саме: Е. соlі № 12 серогрупи 08, Е. соlі №18 серогрупи О26, Е. соlі № 21 серогрупи О111, Е. соlі №48 серогрупи О138, К. pneumoniae №60, P. aeruginosa № 4, S. epidermidis №30, які були ізольовані в свинарському господарстві СООО «Злагода» Троїцького району Луганській області від загиблих поросят групи 0-2, хворих на інфекційні пневмоентерити. 42890 4 Приклад 2. Накопичення бактерійної маси умовно патогенних бактерій. Для виготовлення вакцини накопичення бактеріальної маси умовно патогенних бактерій проводили на МПА з додаванням 10,0 % дріжджового аутолізату крові (ДАК) у 1,5 л матрацних колбах. Матричні культури епізоотичних штамів Е. соlі №12 серогрупи О8, Е. соlі № 18 серогрупи О26, Е. соlі №21 серогрупи О111, Е. соlі № 48 серогрупи О138, К. pneumoniae №60, P. aeruginosa № 4, S. epidermidis №30 вирощували у пробірках з 9,0 см3 МПБ за температури 37,5±0,5 °С на протязі 20,0±2,0 годин з розрахунку 1 пробірка на матрас з 250,0 см3 щільного поживного середовища. Вирослими культурами бактерій засівали матраси, які після висіву витримували агаром вниз за кімнатної температури 20-30 хвилин, а потім перевертали агаром догори, розміщували в термостаті і вирощували за температури 37,5±0,5 °С впродовж 18-22 годин в залежності від накопичення біомаси. Після візуальної перевірки чистоти росту культур, робили мазки, які фіксували на полум'ї спиртівки і фарбували за Грамом. Суспензії бактерій були типовими до штамів Е. соlі (№12, 18, 21 48), К. pneumoniae №60, P. aeruginosa № 4, S. epidermidis №30 і не мали домішок сторонніх бактерій. З матрасів зливали конденсат і в кожну матрасну колбу наливали по 15,0-20,0 см3 стерильного фосфатно-буферного фізіологічного розчину. Біомасу бактерій змивали коливанням матрасу. Суспензії умовно патогенних мікроорганізмів стандартизували шляхом вимірювання об'єму і визначення кількості мікробних клітин, яку проводили за стандартом каламутності ДНКІБШМ (1,0·109 мікробних клітин в 1 см3). Встановлювали концентрацію 10·109 мікробних клітин шляхом додавання стерильного фосфатно-буферного фізіологічного розчину. Приклад 3. Виготовлення корпускулярного антигену. В отриману стандартизовану мікробну завись штамів Е. соlі (№12, 18, 21 48), К. pneumoniae №60, P. aeruginosa № 4, S. epidermidis № 30 додавали інактиватори (32,3-32,6 % розчин пероксиду водню та 38,0 % розчину формальдегіду, для одержання кінцевої їх концентрації відповідно у 0,3 % та 0,1 %). Після чого витримували впродовж 15,0 годин за температури 37,5±0,5 °С для повної девіталізації. Проводили об'єднання антигенних препаратів, виготовлених з виробничих штамів Е. соlі (№12, 18, 21 48), К. pneumoniae №60, P. aeruginosa №4, S. epidermidis № 30 у співвідношенні 1:0,5:0,25:0,15, після чого вимірювали концентрацію мікробних тіл в одержаній бактеріальній масі, суспензію бактерій доводили фосфатно-буферним розчином до густоти 8,0 млрд. м.к./см3. До корпускулярних антигенів додавали при постійному перемішуванні стерильну суспензію аеросилу в розчині 0,9 % натрію хлориду (10 % від об'єму антигену). Конструювання вакцини проводили з таким розрахунком, щоб в 1,0 см3 готового імунологічного біопрепарату містилося 5·109 мікробних клітин. 5 42890 Приклад 4. Контроль вакцини. Стерильність і повноту інактивації вакцини інактивованої проти пневмоентеритів поросят, спричинених умовно патогенною мікрофлорою визначали за ДСТУ 4483. Вакцина була стерильною. Нешкідливість вакцини визначали за ГСТУ 46.024-2002. Виготовлений препарат був нешкідливим. Залишкову кількість перекису водню в вакцині визначали перманганатметричним способом, концентрація якого в готовому препараті не перевищувала 0,1 %. Залишкову кількість формальдегіду в вакцині визначали за кількістю формальдегіду в досліджуваній пробі, концентрація якого в готовому препараті не перевищувала 0,1 %. Імуногенність серії вакцини перевіряли на 140 білих мишах. Вакцину вводили 70-ти мишам підшкірно дворазово з інтервалом 14 діб у дозі 0,5 см3. Інших 70 мишей (контрольна група), які залишились, не вакцинували. Через 14 днів після другого введення вакцини всіх щеплених мишей розділяють на 7 груп по 10 голів і кожній групі, тварин відповідно заражали внутрішньочеревно добовими бульйонними культурами контрольних штамів Е. соlі №№ (12, 18, 21, 48), К. pneumoniae №60, P. aeruginosa №4, S. epidermidis №30.у дозі в 0,5 см34 ЛД50 в 0,5 см3. Не щеплених мишей (контрольні) також розділяли на 7 груп по 10 тварин в кожній і заражали внутрішньочеревно культурою контрольних штамів, а саме: Е. соlі №№ (12, 18, 21, 48), К. pneumoniae №60, P. aeruginosa №4, St. epidermidis у дозі в 04 ЛД50 в 0,5 см3. За дослідними тваринами вели спостереження протягом 10 діб, обліковуючи випадки загибелі тварин. Вакцину вважали імуногенною в тому випадку, коли після контрольного зараження виживала не менше 100 % вакци Комп’ютерна верстка І.Скворцова 6 нованих мишей і гинуло не менше 100 % мишей у контрольних групах за 10 днів спостереження. Імуногенну активність вакцини потрібно також досліджувати додатково на цільових видах тварин (поросятах). Антигенність серії вакцини перевіряли 20 білих мишах, 20-ти піддослідним тваринам вакцину вводили підшкірно дворазово з інтервалом 14 днів у дозі 0,5 см3. Інших 20 мишей, які залишили, не вакцинованими. Через 14 днів після другого введення вакцини у мишей відбирали кров і проводили постановку реакції аглютинації з антигеном (об'єднані інактивовані суспензії бактерій без додавання ад'юванту). Серію вакцини вражали антигенною, якщо у щеплених тварин виявляють рівень антитіл в титрі не нижчі 4,5 log2. Реактогенну властивість серії вакцини перевіряли на 20 поросят віком 0-2 місяців; Піддослідним тваринам вакцину вводили підшкірно у дозі 3,0 см3. Протягом трьох днів враховували температурну реакцію, загальний стан та місцеву реакцію у піддослідних тварин. Наявність підвищення температури в момент огляду від 40,0° до 40,5 °С розцінювали як слабку, підйом температури від 40,6° до 41,1 °С - середню, від 41,2 °С і вище сильну загальну реакцію. Гіперемія шкіри без інфільтрату на місці введення і запальний інфільтрат діаметром до 2,0 см розцінювали як слабку, інфільтрат діаметром від 2,1 до 5,0 см інтерпретують як середню, інфільтрат більше ніж 5,1 см в діаметрі або наявність лімфаденіту і лімфангіту вважали за сильну місцеву реакцію. Серію вакцини вважали малореактогеною, якщо середні температурні реакції були знайдені не більш ніж в 7,0 % або тільки середні температурні й місцеві реакції виявлялися не більше ніж в 12,0 % випадків. Прояву сильних реакцій не повинно бути. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601