Спосіб оцінки пошкоджень моноцитів та альвеолярних макрофагів

Спосіб оцінки пошкоджень моноцитів та альвеолярних макрофагів шляхом дослідження крові або бронхоальвеолярної рідини та виз Винахід, що заявляється, стосується медицини, точніше внутрішніх хвороб, та призначений для діагностики та лікування захворювань з втягуванням макрофагального ланцюга резистентності організму Макрофаги та моноцити є клггинними факторами природної резистентності організму і проявляють активність у всіх тканинах, органах і порожнинах, можуть виходити на поверхню слизових оболонок і там здійснювати захисну функцію (1) Альвеолярні макрофаги (AM) представляють собою гетерогенну популяцію клггин, в якій розрізняють кілька фенотипів (2) Субпопуляцм альвеолярних макрофагів характеризуються за наявністю ВІДПОВІДНИХ маркерів на їх поверхні Крім того, AM - це гетерогенна популяція фагоцитів, які являються клггинами на різних стадіях активації та диференцировки (3) Ці КЛІТИНИ здібні змінювати належність до ВІДПОВІДНОГО фенотипу, який регулює їх функціональні властивості за рахунок мембранних антигенів (4) Модуляція мембранних антигенів, ймовірно, допомагає AM еффективно регулювати фагоцитуючу активність в легенях Критеріями функціональної активності макрофагів можуть бути фагоцитарна активність та бактерицидні властивості, здібність до розпластання, агрегації, контактуванню з лімфоцитами Для дослідження впливу різних факторів на функціональну активність макрофагів їх культивують с лімфокшами, інтерферонами, гормонами тимусу та іншими біологічно активними речовинами (5) Найбільш близьким прототипом ми вважаємо мікроскопічний спосіб визначення фагоцитарної Зоя начення їх функціональної активності, який відрізняється тим, що альвеолярні макрофаги або моноцити периферичної крові культивують в рідині з додаванням бичачого альбуміну та антибіотиків протягом семи днів при температурі 37°С, після чого клітини центрифугують, додають моноклональні антитіла і після завершення інкубації підраховують клітини та оцінюють рівень пошкодження моноцитів та альвеолярних макрофагів активності макрофагів, який передбачає вивчення фарбованих препаратів клггин в прохідному СВІТЛІ за допомогою свггового або люмінесцентного мікроскопу Але недоліками цього методу є його суб'єктивність, що пов'язано з помилками стандартизації, неврахуванням гетерогенності популяцій моноцитів та макрофагів, а також великим впливом на показники різноманітних умов культивування клггин (5) Задача, яка вирішується способом, що заявляється, полягає у підвищенні ефективності діагностики та лікування внутрішніх захворювань з урахуванням пошкоджень макрофагального ланцюга імунітету Технічний результат полягає в тому, що досягається більш патогенетично зумовлена об'єктивна діагностика ушкоджень макрофагів, що дає змогу своєчасно призначити адекватне лікування Задача вирішується тим, що альвеолярні макрофаги або моноцити периферичної крові культивують в рідині RPMI-1640 із додаванням 10% шактивованого бичачого альбуміну і антибіотиків (50 U/мл пеніциліну, 50 мкг/мл гентаміцину і 50 мкг/мл стрептоміцину) Підрахунок клітин проводився за допомогою лічильника клггин 2-Ю6 клггин поміщали в пластикові шестилункові планшети для культивування тканин і ставили на дві години у водяний інкубатор при температурі 37°С Кпггини, які не адгезувалися, аспірувались, а планшети промивалися з використанням PBS, після чого добавлялося середовище для тривалої інкубації адгезованих макрофагів Середовище, у якому культивувалися AM, змінюва (О (О со 43662 лося кожні два дні разом з досліджуваними препаратами Після семи днів культивування клггин центрифуговали на мікроцентрифузі з максимальною швидкістю 12000 х g протягом 20 сек Середовище, в якому культивувались клггини, вилучалося, а клггинний осад (0,5106 клггин) ресуспендували в 500 мкл фосфатного буферу з додаванням 3,5% розчину бичачого сивороткового альбуміну Моноклональні антитіла до RFD1 поверхневим антигенам (ІдМ миші) та RFD7 (lgG1 миші) додавали ВІДПОВІДНО В разведенні 1 200 Отримані зразки шкубували ЗО хв при кімнатній температурі Процес інкубації закінчували центрифугуванням і аспірацією надосадної рідини Клітинний осад промивали 3 рази розчином фосфатного буфера Осад знову суспендували у фосфатному буфері з додаванням бичачого сивороткового альбуміну Флюоресцуючий антимишиний ІдМ та антимишиний ІдМ помічений R-фикоеритрином були додані ВІДПОВІДНО в розчині 1 100 та шкубувались ЗО хв при кімнатній температурі Після закінчення інкубації клітинний осад тричі промивали з використанням фосфатного буферу Кпггини суспендували в 1% розчині формальдегіду в фосфатному буфері та зберігали при 4°С до проведення цитометричного аналізу Флоуцитометричний аналіз проводили за допомогою FACScan флоуметру з використанням програмного забезпечення ЗО Приклади Вплив інтерферону-гамма та дексаметазону на розподілення макрофагів людини Умови культивування RFD1 + RFD7+ RFD1+/RFD7+ Моноцити крові 6% 10% 56% Моноцити + ІФ-у 67% 8% Моноцити + Дек 2% 60% 15% Альвеолярні макрофаги 8% 12% 64% 48% 4% 39% AM + ІФ-у 3% 57% AM + Дек Таким чином даний спосіб оцінки пошкодження моноцитів та альвеолярних макрофагів може використовуватись для клінічної оцінки показ ників неспецифічної резистентності організму, а також для визначення різноманітного впливу ендогенних та екзогенних факторів на стан загальної резистентності організму Виражене пригнічення неспецифічної резистентності організму має місце при алергічних захворюваннях, особливо під час їх загострення (бронхіальна астма, астматичний бронхіт), при дефіциті харчування, в період адаптації організму до нових кліматичних умов, а також при несприятливих умовах навколишнього середовища (радіація, ХІМІЧНІ агенти та ІНШІ фактори) При порівнянні з прототипом даний спосіб оцінки пошкодження моноцитів та альвеолярних макрофагів дозволяє проводити дослідження в динаміці, яка дає можливість побачити зміни резистентності під впливом лікування, що проводиться, або іншої дії Крім того, деякі лікарські препарати, які широко використовуються для лікування різних хвороб (антибіотики, кортикостероїди, імунодепресанти), можуть змінювати неспецифічну резистентність, у зв'язку з чим ці засоби необхідно назначати суворо за показниками, під контролем стану резистентності хворих Література 1 Войтенко Б О , Окулов В Б Основные характеристики макрофага (М) как клетки-эффектора//Вестн Рос АМН -1995 - N 4 -С 59-64 2 Poulter L W , Rook G A , Steele J et al Influence of 1 25-(OH) 2 vitamin D3 and gamma mterferon on the phenotype of human peripheral blood monocyte-denved macrophages // Infect Immunol-1987 - Vol 55 -P 2017-2020 3 Semenzato G Immunology of interstitial lung diseases cellular events taking place in the lung of sarcoidosis, hypersensitivity pneumonitis and HIV infection//Eur Respir J -1991 - Vol 4 - P 94-102 4 Spiten M A , Clarke S W , Poulter LW Alveolar macrophages that suppress T-cell response may be crucial to the pathogenic outcome of pulmonary sarcoidosis // Eur Respir J -1992 - Vol 5 - P 394-403 5 Пастер Е У , Овод В В , Позур В К и соавт Иммунология Практикум -К Выща шк Изд -во при Киев ун-те, 1989 - 304 с Тираж 50 екз Відкрите акціонерне товариство «Патент» Україна, 88000, м Ужгород, вул Гагаріна, 101 (03122) 3 - 7 2 - 8 9 (03122) 2 - 5 7 - 0 3 43662