Використання штаму staphylococcus aureus 2708 для визначення стійкості клінічних штамів s. aureus до оксациліну

Використання штаму Staphylococcus aureus 2708 для визначення стійкості клінічних штамів S. aureus до оксациліну. (19) (21) u200900258 (22) 14.01.2009 (24) 12.10.2009 (46) 12.10.2009, Бюл.№ 19, 2009 р. (72) МАКУШЕНКО ОЛЕКСАНДР СЕРГІЙОВИЧ, ПОЛІЩУК ОЛЕНА ІВАНІВНА, АВДЄЄВА ЛІЛІЯ ВАСИЛІВНА, В'ЯЛИХ ЖАННА ЕДУАРДІВНА, ПОКАС 3 риду мутністю 0,5 одиниць за стандартом McFarland. Стерильний ватний тампон занурюють в суспензію, притискають до стінки пробірки і віджимають надлишок рідини. Доторкаються тампоном до поверхні агару Мюллера-Хінтона, який містить 4% натрію хлориду та 6мкг/мл оксациліну або штрихом проводять по поверхні площею 2-3см2. Можна використати інший спосіб нанесення культури на поживне середовище: з допомогою піпетки наносять 10мкл суспензії мікроорганізмів 0,5 одиниць за стандартом McFarland розведеної в 100 разів. Інкубують при температурі 30-35°С не менше 24 годин. У випадку якщо середовище має задовільні ростові властивості маємо ріст S. aureus 2708 стійкого до оксациліну, ріст чутливого до оксациліну штама S. aureus має бути відсутній. Якщо на середовищі після інкубації наявний ріст чутливого до оксациліну штама або відсутній ріст обох контрольних штамів, то середовище не може бути використане для визначення чутливості клінічних штамів до оксациліну. Опираючись на ці критерії властивостей поживного середовища визначають чутливість клінічних штамів до оксациліну: відповідно стійкий до оксациліну штам дає ріст після інкубації, а чутливий рости не буде. Висівання контрольних стійкого та чутливого штамів проводять до випробування клінічних штамів на чутливість до оксациліну або паралельно з ним. Приклад 2. Визначення якості тест-системи Slidex MRSA Detection виробництва BioMerieux, Франція, для реєстрації продукції штамами S. aureus пенцилінзв'язуючого білка (ПЗБ) 2а. Чисті культури контрольних штамів виду S. aureus чутливого до оксациліну та S. aureus 2708, у якості продуцента ПЗБ 2а., висівають на кров'яний агар для отримання ізольованих колоній та інкубують при 37°С протягом 18-24 годин. Подальша послідовність технологічних дій проводиться згідно з відомою інструкцією по використанню набору Slidex MRSA Detection виробництва BioMerieux, Франція [2]. Вносять в мікропробірку (пробірку Еппендорфа) 4 краплі реактиву 1 для екстракції (0,1моль/л розчин NaOH). Стерильно вносять в пробірку дві повних 1,5мкл - петлі культури. Ретельно гомогенізують. Закривають пробірку та поміщають її на водяну баню температурою 95-100°С на 3 хвилини (не більше 5 хвилин). Охолоджують пробірку до кімнатної температури. Вносять в пробірку 1 краплю реактиву 2 для екстракції (0,5моль/л КН2РО4) та ретельно гомогенізують. Центрифугують при 1500g протягом 5 хвилин. Вносять 1 краплю сенсибілізованого латексного реактиву в дослідну лунку на пластині. В другу лунку вносять реактив для негативного контролю. Додають по 50мкл надосадової рідини з пробірки після центрифугування в обидві лунки. Ретельно перемішують пластмасовими паличками, що входять в набір, та рівномірно розподіляють по всій поверхні вміст 44415 4 обох лунок. Погойдують пластину руками чи на шейкері протягом 3 хвилин. Оцінюють результат. Тест-система придатна до використання для визначення продукції ПЗБ 2а у клінічних штамів якщо у випадку штама продуцента пенцилінзв'язуючого білка є аглютинація в досліді та немає в негативному контролі, а у випадку штама, що не є продуцентом пенцилінзв'язуючого білка ПЗБ 2а аглютинація відсутня і в досліді і в негативному контролі. Тест-система непридатна для використання якщо аглютинація відсутня у випадку штама продуцента пенцилінзв'язуючого білка в досліді або спостерігається аглютинація в досліді у випадку штама, що не є продуцентом пенцилінзв'язуючого білка ПЗБ 2а. Якщо є аглютинація в негативному контролі результат недійсний, дослід повторюють, врахувуючи можливі помилки. Приклад 3. Визначення якості комерційних дисків з оксациліном, цефокситином та Е-тестів. Диски з оксациліном. Випробування проводять на чашках Петрі з агаром Мюллера-Хінтона з 4% натрію хлориду, товщиною шару 4мм. Чисті культури контрольних штамів виду S. aureus чутливого до оксациліну та S. aureus 2708 висівають на кров'яний агар для отримання ізольованих колоній та інкубують при 37°С протягом 18-24 годин. Петлею знімають кілька колоній S. aureus чутливого до оксациліну та S. aureus 2708 та готують суспензії в стерильному 0,9% розчині натрію хлориду мутністю 0,5 одиниць за стандартом McFarland. Засівають поверхню однієї чашки Петрі S. aureus чутливим до оксациліну та одну чашку S. aureus 2708. Для цього окремими стерильними ватними тампонами наносять на поверхню агару в чашках Петрі суспензії, рівномірно покриваючи всю поверхню агару. Перед нанесенням суспензії мікроорганізму на поверхню середовища тампон слід притиснути до стінки пробірки щоб видалити надлишок суспензії. Кладуть на поверхню агару кілька дисків з 1мкг оксациліну та інкубувати при 37°С. Облік результатів після 24 годин інкубації. Вимірюють діметри зон затримки росту навколо дисків. Якість дисків вважають задовільною якщо: для стійкого до оксациліну штама діаметр зони затримки росту не більший ніж 10мм, для чутливого до оксациліну штама - не менший ніж 13мм [5]. Диски з цефокситином. Випробування проводять на чашках Петрі з агаром Мюллера-Хінтона товщиною шару 4мм. Чисті культури контрольних штамів виду S. aureus чутливого до оксациліну та S. aureus 2708 висівають на кров'яний агар для отримання ізольованих колоній та інкубують при 37°С протягом 18-24 годин. Петлею знімають кілька колоній S. aureus чутливого до оксациліну та S. aureus 2708 та готують суспензії в стерильному 0,9% розчині натрію хлориду мутністю 0,5 одиниць за стандартом McFarland. 5 44415 Засівають поверхню однієї чашки Петрі S. aureus чутливим до оксациліну та одну чашку S. aureus 2708. Для цього окремими стерильними ватними тампонами наносять на поверхню агару в чашках Петрі суспензії, рівномірно покриваючи всю поверхню агару. Перед нанесенням суспензії мікроорганізму на поверхню середовища тампон слід притиснути до стінки пробірки щоб видалити надлишок суспензії. Кладуть на поверхню агару кілька дисків з 30мкг цефоксинтину та інкубують при 37°С. Облік результатів після 24 годин інкубації. Вимірюють діметри зон затримки росту навколо дисків. Якість дисків вважають задовільною якщо: для стійкого до оксациліну штама діаметр зони затримки росту не більший ніж 19мм, для чутливого до оксациліну штама - не менший ніж 20мм [5]. Е-тест з оксациліном. Випробування проводять на чашках Петрі з агаром Мюллера-Хінтона товщиною шару 4мм. Чисті культури контрольних штамів виду S. aureus чутливого до оксациліну та S. aureus 2708 висівають на кров'яний агар для отримання ізольованих колоній та інкубують при 37°С протягом 18-24 годин. Петлею знімають кілька колоній S. aureus чутливого до оксациліну та S. aureus 2708 та готують суспензії в стерильному 0,9% розчині натрію хлориду мутністю 0,5 одиниць за стандартом McFarland. Засівають поверхню однієї чашки Петрі S. aureus чутливим до оксациліну та одну чашку S. aureus 2708. Для цього окремими стерильними ватними тампонами наносять на поверхню агару в чашках Петрі суспензії, рівномірно покриваючи всю поверхню агару. Перед нанесенням суспензії мікроорганізму на поверхню середовища тампон слід притиснути до стінки пробірки щоб видалити надлишок суспензії. Кладуть на поверхню агару Етест. Інкубують при 37°С. Облік результатів проводять після 24 годин інкубації. Критеріями оцінки якості для Е-тесту бу Комп’ютерна верстка М. Ломалова 6 дуть значення мінімальної інгібуючогої концентрації. У випадку стійкого штаму зона росту починається не нижче 4мкг/мл, у випадку чутливого штаму - не вище 2мкг/мл. Висновок: Штам S. aureus 2708 доступний в Україні. Біологічні властивості штама S. aureus 2708 як продуцента ПЗБ2а дозволяють використовувати його як контрольний штам при визначенні стійкості клінічих ізолятів до оксациліну, для перевірки ростових властивостей поживних середовищ, для контролю якості наборів для визначення продукції пенцилінзв'язуючого білка 2а і при контролі якості комерційних дисків з оксациліном. Наявність штама S. aureus 2708 у вітчизняній колекції дозволить уникнути витрат коштів на купівлю штамів у закордонних колекціях та на періодичне поновлення цих штамів. Використана література: 1. Дехнич А. В. Выявление резистентности к метициллину и другим β-лактамным антибиотикам методом скрининга // Современные методы клинической микробиологии. - Выпуск 1. - 2003. - С. 63-68. ® 2. Інструкція з використання набору Slidex MRSA Detection для визначення продукції штамами S.aureus пеніцилінзв'язуючого білка ПЗБ2а виробництва BioMerieux, Франція (REF 73 117). 3. Методичні вказівки MB 9.9.5 - 143 - 2007 "Визначення чутливості мікроорганізмів до антибактеріальних препаратів" (2007), пункт 5.4, ст. 40. 4. Інструкція з використання тест-системи АТВ Staph 5 для визначення стійкості стафілококів до антибіотиків, виробництва BioMerieux, Франція (REF 14325). 5. Страчунский Л.С., Белькова Ю.А., Дехнич А.В. Внебольничные MRSA - новая проблема антибиотикорезистентности. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2005. Том 7, №1. - С. 32-46. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601