Використання ванкоміцинрезистентного штаму enterococcus faecium 113 для визначення стійкості клінічних штамів enterococcus sp. до ванкоміцину

Використання ванкоміцинрезистентного штаму Enterococcus faecium 113 для визначення стійкості клінічних штамів Enterococcus sp. до ванкоміцину. (19) (21) u200900256 (22) 14.01.2009 (24) 12.10.2009 (46) 12.10.2009, Бюл.№ 19, 2009 р. (72) ЯНОВСЬКА ВАЛЕНТИНА ВОЛОДИМИРІВНА, ПОЛІЩУК ОЛЕНА ІВАНІВНА, МАКУШЕНКО ОЛЕКСАНДР СЕРГІЙОВИЧ, ТКАЧИК ІРИНА ПЕТРІВНА, ГАЛАГУЗА ЮРІЙ ПЕТРОВИЧ 3 вирощеної на неселективних поживних середовищах, супендують, доводять до концентрації 0,5 за McFarland і наносять 10,0мкл суспензії на поверхню агару. Інкубують при температурі 35°С протягом 24год. Для контролю якості використовують штами чутливих і резистентних ентерококів. Інтерпретація результатів. Агар на серцево-мозковому екстракті з 6,0мг/см3 ванкоміцину: Штам E.faecium чутливий до ванкоміцину - буде відсутній ріст. Штам E.faecium 113 - буде добре видимий суцільний ріст. Досліджувані штами - наявність на місці нанесення культури більш ніж однієї колонії свідчить про стійкість штаму до ванкоміцину, відсутність росту - про чутливість штаму до ванкоміцину. Відсутність росту штаму E.faecium 113 на поживному середовищі з ванкоміциниом свідчить про непридатність середовища для використання. Агар на серцево-мозковому екстракті без ванкоміцину: Штам E.faecium чутливий до ванкоміцину - буде добре видимий суцільний ріст. Штам E.faecium 113 - буде добре видимий суцільний ріст. Досліджувані штами - буде добре видимий суцільний ріст - при відсутності росту досліджуваного штаму на середовищі без ванкоміцину не дозволяє з впевненістю стверджувати, що інгібуючим фактором є саме ванкоміцин. Відсутність росту контрольних штамів на поживному середовищі без ванкоміцину свідчить про непридатність середовища для використання. У випадках непридатності середовища до використання повторюють дослід, використовуючи іншу серію поживного середовища та враховують можливі помилки при попередній постановці. Приклад 2. Визначення мінімальної інгібуючої концентрації (МІК) ванкоміцину. Дослідження проводять мікрометодом у 96лункових планшетах в об'ємі 0,2мл. Чисту культуру 10 клінічних штамів Enterococcus sp. та контрольних (чутливого та стійкого) штамів висівають на кров'яний агар для отримання ізольованих колоній та інкубують при 37°С протягом 18-24 годин. Петлею знімають кілька колоній та готують суспензію в стерильному 0,9% розчині натрію хлориду мутністю 0,5 одиниць за стандартом McFarland. Готують розчин ванкоміцину концентрацією 1000мкг/мл у дистильованій воді. Далі готують робочі двократні розчини антибіотику: 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512мкг/мл у бульйоні Мюллер-Хінтона. Вносять по 0,1мл кожного розведення ванкоміцину в окрему лунку ряду. Таких рядів готують по одному на кожну досліджувану культуру, і два для контрольних штамів - стійкого та чутливого. Кожен ряд підписують. В кожну лунку відповідного ряду вносять по 0,1мл суспензій досліджуваної культури, та контрольних штамів. Інкубують 24 год при температурі 35°С. Інтерпретація результатів: 44414 4 Штам E.faecium чутливий до ванкоміцину - МІК 1-4мкг/мл Штам E.faecium 113 - МІК 64мкг/мл Досліджуваний штам - МІК - концентрація ванкоміцину в першій лунці ряду де візуально відсутній ріст. Приклад 3. Визначення наявності VanA гену резистентності до ванкоміцину. Готують суспензію досліджуваних штамів Enterococcus sp. та контрольних (стійкого та чутливого) штамів ентерококів за стандартом мутності McFarland 3 у фізіологічному розчині. За допомогою набору реагентів для виділення ДНК -ДНКсорб-В, виробництва «Амплисенс» або іншими наборами виділяють ДНК. Для цього в пробірки об'ємом 0,2мл вносять по 2мкл праймерів, та 2,5мкл суміші трифосфатів. Покриваємо вміст пробірок розтопленим воском - 7мкл. На віск наносимо 0,5мл Taq-полімерази, 10мкл буферу та 5мкл виділеної ДНК (або ПЛР-суміш 2). Реакція проходить в об'ємі 25мкл. Пробірки поміщають в ампліфікатор. Ампліфікацію починають з гарячого старту; 940°С на 2хв.; 94°С на 30сек, 540°С на 30сек і 720°С на 30сек для наступних 30 циклів; і 720°С на 10хв для останнього циклу. Детекцію продуктів ПЛР проводять за допомогою електрофорезу у 2,5% агарозному гелі з додаванням 0,5мг бромистого етидію [2, 4]. Інтерпретація результатів: Штам E.faecium чутливий до ванкоміцину - напроти лунок будуть відсутні видимі смужки фрагментів ДНК. Штам E.faecium 113 стійкий до ванкоміцину з типом VanA - в гелі напроти лунки з праймерами до типу VanA буде видима смужка фрагментів ДНК. Досліджуваний штам ентерококу має тип резистентності VanA якщо напроти лунки із відповідними праймерами буде смужка фрагменту ДНК і вона знаходитиметься на одному рівні зі смужкою штама E.faecium 113. Висновок: Штам E.faecium 113 доступний в Україні. Біологічні властивості штаму E.faecium 113 дозволяють використовувати його як контрольний штам при визначенні стійкості клінічних ізолятів Enterococcus sp. до ванкоміцину, для перевірки ростових властивостей поживних середовищ для визначення стійкості клінічних ізолятів до ванкоміцину та визначення VanA типу резистентності. Наявність штама E.faecium 113 у вітчизняній колекції дозволить уникнути витрат коштів на купівлю штамів у закордонних колекціях та на періодичне поновлення цих штамів. Джерела інформації: 1. Dutka-Malen S., Evers S., Courvalin P. 1995. Detection of Glycopeptide Resistance Genotypes and Identification to the Species Level of Clinically Relevant Enterococci by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 33(1): 24-27 2. Miele A., Banderam M., Goldestein B.P. 1995. Use of Primers Selective for Vancomycin Resistance Genes To Determine van Genotype in Enterococci and To Study Gene Organization in VanA Isolates. Antimicrob Agents Chemother. 39(8): 1772-1778. 5 44414 3. Інструкція з використання набору Positive Break Point Combo 9. - Панель для ідентифікації та визначення чутливості до антибіотиків грампозитивних мікроорганізмів з допомогою бактеріологіч Комп’ютерна верстка Н. Лиcенко 6 ного аналізатора MicroScan autoSCAN4, виробництва DADE BEHRING, США. 4. Інструкція з використання набору "ДНКсорб-В", виробництва «Амплисенс», Центральний науково-дослідний інститут епідеміології, Росія. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601