Живильне середовище для одержання біомаси staphylococcus aureus

Винахід відноситься до медицини, а саме до медичної мікробіології, зокрема до одержання живильних середовищ для культивування бактерій роду Staphylococcus. Біомаса стафілококу є сировиною для одержання антистафілококових препаратів: вакцини, фагу та протеїну А. Для вирощування стафілококів застосовуються декілька живильних середовищ: МП А, молочно-сольовий агар, середовища Чистовича І 1,2 І та Чепліна і Бернса І2І. Всі перераховані середовища виготовляються на основі м'ясо-пептонного агару. Відмінності між ними полягають в використанні додаткових живильних факторів: яєчних жовтків I1I, молока I1I, лактози I1I, що слугують діагностичним цілям при визначенні лецитінази, патогенних властивостей. Ознаками, що збігаються з суттєвими ознаками винаходу, що заявляється, є використання живильної білкової основи. Використання м'ясного середовища (МПА) та харчових добавок (жовток, молоко) зумовлює високу собівартість усіх наведених середовищ. Прототипом середовища, яке пропонується, є середовище молочно-сольовий агар, до складу якого входять такі інгредієнти: м'ясо-пептонний агар; NaCl 10%; молоко 10-20%; рН 7,2. Ознаками прототипу, що збігаються з такими середовищами, що пропонується, є наявність в середовищі NaCI та рН-7,2. На відміну від прототипа ми пропонуємо використовувати як живильну основу солянокислий гідролізат активного мулу замість м'ясо-пептонного агару та молока. В основу винаходу покладено задачу розробити середовище для культивування стафілококів шляхом заміни харчової сировини (м'ясо-пептонного агару, молока) продуктами переробки активного мулу, забезпечити активність росту, яка перевищує або не поступається такій на середовищі - прототипі, і знизити таким чином його собівартість. Ознаки винаходу: основа - солянокислий гідролізат активного мулу, одержаний при концентрації соляної кислоти 1-5%; вміст амінного азоту - 120-140мг%, рН-7,2, вміст агар-агару - 2%, наявність NaCI. Ознакою, відмінною від прототипа, є використання як живильної органічної основи солянокислого гідролізата активного мулу, одержаного при концентрації соляної кислоти 1-5%. Ці ознаки є достатніми у всіх випадках, на які поширюється обсяг правової охорони. Відомості, що підтверджують можливість здійснення винаходу: Експериментально були одержані такі дані: - підібрано умови трансформації осаду активного мулу у форму, придатну для культивування мікроорганізмів; - підібрано оптимальну концентрацію амінного азоту для росту ста філококу на даній основі. Активний мул являє собою сукупність мікроорганізмів, найпростіших, червів, деяких безхребетних , що здійснюють очистку стічних вод у каналізаційних спорудах. Було досліджено можливість одержання живильної основи з використанням кислотного та лужного гідролізу активного мулу. Для цього активний мул відстоювали на протязі однієї години, зливали надлишок води і вносили різні концентрації НС1 та NaOH у вигляді 36% та 40% розчинів відповідно. Суміші автоклавували 2 год при 1,5атм, після чого їх розбавляли дистильованою водою у відношенні 1:1 і освітлювали активаваним вугіллям. Для цього в розбавлені гідролізати вносили активоване вугілля, (2г на 100мл), автоклавували 20хв. при 1атм. Просвітлені гідролізати активного мулу відфільтрували через склотканину і визначали вміст амінного азоту (табл.1). Таблиця 1 Амінний азот, одержаний при різних концентраціях НС1 та NaOH Концентрація гідролізуючого агента % 0,5% 1,0% 2,0% 3,0% 5,0% 10,0% 18,0% Амінний азот, мг % HCl Амінний азот, мг % NaOH 318±86 386,7±75 270±33 274±51 276±101 113±108 102±55 105±43 199±21 210±49 190±64 174±39 234±69 224±70 Як видно із наведених даних, НСl забезпечує значний вміст амінного азоту при низьких концентраціях (1%), NaOH дає задовільні значення амінного азоту при збільшенні концентрації до 10-18%. Тому надалі гідроліз осаду активного мулу здійснювали відповідно при 1% НСl та 10% NaOH. Для перевірки ростових якостей одержаних гідролізатів із них було виготовлено живильні середовища за таким прописом: гідролізати нейтралізували 10н NaOH та 6н НСl відповідно до рН7,0-7,2 і розбавляли водою до вмісту амінного азоту 120-140мг%. За рахунок нейтралізації надлишку кислоти та лугу утворювався NaCl, концентрація якого становила в середовищах із НСl - гідролізатів 0,5-0,8%, а із NaOH - гідролізатів - порядку 7%. В середовища вносили 2,0% агару. Перевірку ростових якостей здійснювали за відомою методикою І 3 І; при цьому на виготовлені середовища здійснюється висів культур в кількості 500, 1000, 104, 105, 106 мікробних клітин в 0,1мл фізіологічного розчину. Наявність росту при висіві 500 та 1000 мікробних клітин є індикаторами задовільної ростовоїякості середовища для взятого мікроорганізму І 3 І (табл.2). Таблиця 2 Ростові якості середовища із активного мулу у відношенні тест-штамів мікроорганізмів Тест-штами Ростові якості, ум.од (+-++++) Основа із НСl - гідролізату Основа із NaOH - гідролізату Посівна доза клітин 500 103 104 105 106 500 103 104 105 106 + + + 5 колоній ++ +++ +++ 10 колоній 23 колонії Bacillus subtilis АТСС 6633 Pseudomonas aeruginosa АТСС 9027 Escherichia coli АТСС 25922 Staphylococcus aureus +++ АТСС 25923 + +++ ++++ ++ ++++ ++++ Candida albicans + + АТСС 885-653 Примітка : підрахунок через 24 години культивування 3 колонії 5 колоній 5 колоній 11 колоній 4 колонії 18 колоній Як видно із наведених в табл.2 даних, в найбільшій мірі середовище із НСl -гідролізату активного мулу підходить для S. aureus. Інші тест-культури виявляють ріст лише при високих посівних дозах, що свідчить про непридатність середовища для їх культивування. Задовільну активність росту на данній основі дає Klebsiella pneumoniae, але при мікроскопічному дослідженні в культура х виявляються форми незбалансованого росту, що не дає можливості рекомендувати дане середовище для представників роду Klebsiella. Середовище на основі лужних гідролізатів активного мулу не мають ростових якостей, незважаючи на достатній вміст амінного азоту. Таким чином, живильна основа, одержана із активного мулу НСІ-гідролізом є придатною для вирощування стафілококів. Оптимальні параметри гідролізу - 1-5% соляної кислоти. Для конструювання живильного середовища для стафілококів необхідно було підібрати концентрацію амінного азоту, яка б забезпечувала оптимальний ріст цього мікроорганізму. Для цього було приготовано ряд живильних середовищ з різним вмістом амінного азоту, в межах 60-180мг%. На чашки Нетрі було висіяно штам S.aureus АТСС 6538-Р в діапазоні посівноії дози 500-106 мікробних клітин (табл.3). Таблиця 3 Активність росту S.aureus на розроблюваному середовищі із активного мулу при різних значеннях амінного азоту Значення амінного Активність росту, умовні одиниці ( + - ++++) Посівна доза азоту, мг % 500 103 104 105 60 + + + ++ 75 + + + ++ 90 +++ +++ +++ ++++ 100 +++ +++ ++++ ++++ 120 ++++ ++++ ++++ ++++ 140 +++ ++++ ++++ ++++ 150 ++ +++ +++ +++ 170 + ++ +++ +++ 180 + + ++ ++ Примітка: *) - наявність форм незбалансованого росту. Облік результатів проведено через 24год. 106 ++ +++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ *) +++*) ++*) Як видно із наведених даних, вміст амінного азоту, що є оптимальним для росту мікроорганізму S.aureus, знаходиться в межах 90-140мг%. Таким чином, проведені експерименти дають можливість прийняти такі параметри при виготовленні середовища для стафілококів із активного мулу: 1) білкова основа - солянокислий гідролізат активного мулу, одержаний солянокислим гідролізом при концентрації кислоти 1-5%; 2) вміст амінного азоту - 90-140мг%. Виготовлення білкової основи здійснюється за такою методикою: 1л активного мулу свіжевідібранного з аеротенку або розмороженого відстоюють 30 хвилин, надлишок води зливають, до осаду додають до 1 л водопровідну воду, відстоюють 30 хвилин, зливають надлишок води і до осаду вносять комерційну соляну кислоту до кінцевої концентрації 1-5%, закорковують ватно-марлевим корком і автоклавують 2 години при 1,5атм. Після автоклавування одержується рідина коричневого кольору з осадком. В гідролізат вносять дистильовану воду у відношенні 1:1 та активоване вугілля із розрахунку 2,0г на 100мл; суміш автоклавують 20 хвилин при 1атм. і відфільтровують через склотканину або полотно. Одержаний гідролізат являє собою прозору рідину світло сірувато-коричневого кольору і має характеристики, наведені в табл.4. Таблиця 4 Характеристика солянокислого гідролізату активного мулу, одержаного із 1л активного мулу № серії 1 2 3 Об'єм одержаного гідролізату, мл 420 380 406 Загальний азот, мг % Амінний азот, мг % 478 350 300 434 324 260 П. Виготовлення живильного середовища для культивування S.aureus включає такі етапи: - нейтралізація гідролізату до рН7,0-7,2; розбавлення до вмісту амінного азоту 90-140мг%; внесення агар-агару - 2,0%; стерилізація 20 хвилин при 120С° Приклад 1 1л активного мулу, одержаного на Диканівській станції аерації М.Харкова, відстояли 30 хвилин, надлишок води злили, добавили водопровідної води до 1л, відстояли 30 хвилин, надлишок води злили, залишилось 420мл крихкого осаду. Внесли 1% НС1 у вигляді 36,5% -ної комерційної кислоти. Розрахунок необхідної кількості здійснили за правилом змішування: Суміш проавтоклавували 2год при 1,5атм., в одержаний продукт чорного кольору внесли активоване вугілля (85г), 430мл дистильованої води і проавтоклавували 20хв. при 1атм. Просвітлений гідролізат світлого сіруватокоричневого кольору відфільтрували через склотканину, визначили вміст амінного азоту, який склав 434мг%. Кількість солянокислого гідролізату, необхідного для приготування 1 л середовища розрахували ви ходячи із міркування, що концентрація амінного азоту в готовому середовищі повинна становити 120мг%, за правилом змішування 276мл гідролізату нейтралізували внесенням 40% NaOH до рН7,2 за індикаторним папером, після чого, вносили дистильовану воду до 1000,0мл. Кінцевий рН7,2 встановлювали за рН-метром, вносили 2,0% агару, автоклавували 20 хвилин при 1атм. Одержане середовище за розрахунковими даними містить 0,67% NaCl. Одержане середовище було використане для одержання біомаси S.aureus штамів №6538 АТСС (музейний), №37 та 38 (клінічні) в порівнянні з молочно-сольовим агаром. Для цього на чашки Петрі суцільним газоном засівали по 0,2мл 5-млн-ої культури досліджуваних штамів. Після 24год культивування культуру змивали фізіологічним розчином і визначали кількість змитих клітин за стандартом каламутності. Порівняння одержаних результатів давало можливість судити про продуктивність досліджуваних середовищ для стафілококів (табл.5). Таблиця 5 Продуктивність досліджуваних середовищ для стафілококів Штами стафілококів № 6538 АТСС №37 (клінічний) №38 (клінічний) Кількість клітин, млрд/ чашку х± d Середовище із Молочно-сольовий активного мулу агар 1046±180 668±125 944,3±84,6 719±134 1374±311 912±87 t (df=5) р 3,03 2.5 2,52 p