Спосіб виготовлення природних g-інтерферонів людини і тварин

1 Спосіб виготовлення природних гамаштерферонів людини і тварин, який включає культивування клітин-продуцентів - імуноцитів в присутності індуктора штерфероногенезу - лектину Вас Subtihs spec при температурі 37,0° - 37,5°С і ПОСТІЙНІЙ аерації з наступним виділенням інтерферонвмісної рідини, який відрізняється тим, що куль О (О 00 тить крім у-ІФНу багато інших речовин невикористані залишки поживного середовища, метаболіти імуноцитів та ш , що можуть бути небайдужими для організму людини та тварини Метою способу, що заявляється, є усунення зазначених недоліків та отримання очищених концентрованих препаратів природних у-ІФНів людини та тварин Поставлена мета досягається наступним чином Суспензію імуноцитів-продуцентів ЩІЛЬНІСТЮ 7кл 1,5 - 3,0 10 /мл культивують в присутності гамаштерфероногенезу - лектину Вас subtihs spec (40мкг/мл суспензії) протягом 36 - 48 годин при 37,0° - 37,5°С та ПОСТІЙНІЙ аерації Клітини та їх залишки видаляють центрифугуванням, надосадову рідину піддають стерилізуючій фільтрації З отриманої штерфероновмісної рідини у-ІФН виділяють шляхом осадження його на скляні мікросфери з поверхнею, розвиненою методом профільного травлення Після осадження у-ІФНу мікросфери промивають фосфатним буфером з Рн = 7,2 для видалення усіх домішок та обробляють фосфатним буфером з NaCI та етиленгліколем для зняття у-ІФНу Щоб позбутися етиленгліколю, рідину діалізують проти дистильованої води в проточному режимі не меньш як 24 години Приклад 1 Вихідна сировина - селезінка людини Отримують суспензію спленоцитів як продуцентів у-ІФНу і проводять праймінг гомологічним ІФНом (200МО/мл, концентрація спленоцитів З 107/мл) протягом 2 - 4 годин при 37,0 - 37,5°С та постійному перемішувані Біосинтез у-ІФНу проводять в присутності індуктору - лектину бактерій Вас subt spec в концентрації ЗО - 40мкг/мл суспензії спленоцитів (концентрація суспензії 1 - 2 107/мл) протягом 36 - 48 годин при 37,0 - 37,5°С, ПОСТІЙНІЙ аерації і перемішуванні Отримана штерферонвмісна рідина має титр антивірусної активності 1024 - 2048МО/мл Для того, щоб позбутися стороніх домішок, а також сконцентрувати препарат використовують скляні мікросфери діаметром 0,2 - 0,8мм, попередньо оброблені водним розчином, що містить 20 - 25% HF та 10 - 15% NH4F, протягом 40хв при 35°С та постійному перемішувані (профільне травлення) та ВІДМИТІ ДИС 44816 ТІЛЬОВНОЮ водою до встановлення нейтральних показників рН Такі мікросфери мають розвинену поверхню, внаслідок чого різко зростає їх спорідненість до глікопротешів, яким є у-ІФН Оброблені мікросфери зберігають під шаром етилового спирту для забезпечення стерильності Для очищення у-ІФНу на мікросферах використовують два буфери Перший (І) готують з розчинів А (0,2М розчин NaH2PO4) та В (0,2М розчин ЫагНРО^ До 360мл розчину А додають 140мл розчину В та доводять до 1л дистильованою водою, рН отриманого буферу -7,2 Другий буфер (II) отримують, додаючи до 1л буферу І 58,5г NaCI та змішуючи 550мл отриманого розчину з 450мл етиленгліколю Стерільні мікросфери відмивають 2 рази стерільною дистильованою водою та 2 рази стерильним фізіологічним розчином До 500мл інтерферонвмісної рідини з титром антивірусної активності 1024 - 2048МО/мл додають 50мл мікросфер та витримують 20хв при ЗО - 35°С та постійному перемішувані Після ЦЬОГО рідину зливають, мікросфери промивають 250мл стерильного буферу І, заливають 50мл стерильного буферу II і витримують 20хв при ЗО - 35°С та постійному перемішуванні Для звільнення від етиленгліколю отриману рідину діалізують проти дистильованої води у проточному режимі протягом 24 - 36 годин Для перевірки того, що отриманий препарат є гомогенним у-ІФНом, визначали його антивірусну активність та вплив на неї високої температури і низьких значень рН, оскільки відомо, що з усіх типів ІФНів тільки у-ІФН втрачає активність після впливу на нього цих факторів Результати наведені у таблиці Приклад 2 Було повторено процедуру прикладу 1, за винятком того, що вихідною сировиною була селезінка свині Результати наведені у таблиці Приклад 3 Було повторено процедуру прикладу 1, за винятком того, що вихідною сировиною була селезінка ВРХ Результати наведені у таблиці Таблиця Результати, отримані у прикладах 1 - З 1 2 3 антивірусна активність до очищення (МО/мл) 2048 1024 1024 антивірусна активність антивірусна активність пісп ісля очищення ля прогрівання 560С, 1 год , (МО/мл) (МО/мл) 32768 160 16384 80 16384 80 Для визначена ступіню чистоти препаратів проводили вертикальний електрофорез в поліакріламідному гелі за Лемлі в системі ДДС-Na В цій системі отримані у прикладах 1 - 3 препарати дали однорідну чітку смугу, що свідчить про високий ступінь їх чистоти З наведених результатів видно, що даний спосіб дозволяє виділити чистий однофазний у-ІФН вільний від сторших домішок і з високою активніс антивірусна активність п ісля обробки НСІ рН=3,1 доба, (МО/мл) 80 40 40 тю -16384 -32768МО/МЛ Результатом впровадження такого способу є отримання природних у-ІФНів людини і тварин, які, по-перше, є більш дешевими, ніж ВІДОМІ за рахунок використання дешевої сировини і відсутності дорогих складних технологій очищення від залишків пектинів, по-друге, характеризуються високою чистотою та активністю 44816 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90