Спосіб отримання лептоспірозного еритроцитарного діагностикума

Спосіб отримання лептосп і розного еритроци використовуватись для КІЛЬКІСНОГО визначення антилептоспірозних антитіл ВІДОМІ способи отримання еритроцитарних діагностикумів для виявлення антитіл проти сальмонел [1], чуми [2], дизентерії [3], бруцел [4], холери [5] і др Ці способи трудомісткі, займають багато часу, потребують дефіцитних реагентів і дають малий вихід цільового продукту Найбільш близьким до запропонованого технічного рішення є спосіб отримання лептоспірозного родоспецифічного еритроцитарного діагностикуму [6] В основі способу лежить виділення і використання лептоспірозного полісахарид ного антигену Для цього накопичують біомасу лептоспір, висушують и етиловим ефіром, потім прогрівають з формамідом при 150°С, охолоджують, центрифугують, а до надосадової рідини додають 2,5 об'єми солянокислого спирту і знову центрифугують Осад розчиняють в дистильованій воді і ДВІЧІ переосаджують в 5 об'ємах ацетону Отриманий осад використовують як антиген для навантаження формалінізованих баранячих еритроцитів Навантаження еритроцитів здійснюють при 37°С 60 хвилин Потім еритроцити 3 рази відмивають фізіологічним розчином і ресуспензують до концентрації 2 - 2,5% Як видно із опису ця технологія довгочасна, потребує приготування великих об'ємів О о со ю 45302 Кожен зі штамів лептоспір Вайнберг (серогруним розчином до концентрації 35мг/мл Отриману па Іктерогеморапя), Москва-5 (серогрупа Гріпотісуспензію в КІЛЬКОСТІ 50мл кожної культури піддафоза), Помона (серогрупа Помона), Хонд-Утрехт ють на протязі 2,5хв дії ультразвуку при частоті (серогрупа Каніколя), 3705 (серогрупа Гебдомадіс) 44Кгц і потужності 50вт/см2 Потім ці три суспензії культивують в середовищі Терських при 28° в об'змішують в рівних об'ємах для одержання суміші ємі 2 - 2,5л на протязі 7 - 1 0 діб, або досягнення антигенів Одержали 150мл суміші антигену Одконцентрації лептоспір в середовищі 1 • 108 - 4 • ночасно готують формалінізовані еритроцити ба108 клітин в 1мл, потім культуру центрифугують рана при 5000 - 6000об/хв протягом 50 - 70 хвилин Для цього до кожних 0,4мл 50% еритроцитів Осад кожної культури ресуспендують в 40 - 60мл барана формалінізованих і відмитих, додають по фізіологічного розчину і знову центрифугують 50 0,04мл бідіазобензідшу, струшують 2сек, додають 70 хвилин при 5000 - 6000об/хв До осаду додають 0,4мл антигену і, постійно перемішуючи, витримуфізіологічний розчин з розрахунку одержання конють при 22°С протягом 15 хвилин Потім еритроцентрації суспензії 35 - 40мг/мл і піддають 2 - З цити тричі відмивають забуференим фізіологічним хвилин дії ультразвуку при частоті 44кГц та потужрозчином рН 7,2, ресуспензують в наповнювачі до ності 50вт/см Суспензію 35 - 40 хвилин центрифуконцентрації 2% Із суміші 150мл лептоспірозних гують при 5000 - 6000об/хв Таким методом готуантигенів і 150мл 50% формалінізованих еритроють надосадову рідину із 3 - 5 культур штамів цитів отримано 3850мл тривалентного лептоспіролептоспір, потім їх змішують в рівних об'ємах для зного діагностикуму Для отримання такої КІЛЬКОСТІ одержання полівалентного антигену Одночасно лептоспірозного діагностикуму відомим способом готують формалінізовані еритроцити барана Для потрібно 90000мл поживного середовища, що в 15 цього 2мл 10% формалізованих еритроцитів ДВІЧІ разів більше ніж запропонованим способом, сковідмивають 5-кратним об'ємом фізіологічного розрочується в 16 разів затрати часу, виключаються чину, забуференого фосфатним 1/15М буфером технологічні процеси з використанням дефіцитних рН 7,2, осад ресуспензують у 0,2мл фізіологічного і коштовних реагентів - ефіру, формаміду, ацеторозчину і додають 0,04 - 0,55мл бідіазобензидшу, ну, етилового спирту Крім того при перевірці виструшують 1 - 2 секунди, додають 0,40 - 0,42мл явлено, що чутливість одержаного по запропоноантигену, витримують при кімнатній температурі ваному способу діагностикуму в 16 раззів вища ніж (18 - 25°С/ протягом 1 4 - 1 6 хвилин постійно перевідомого мішуючи, потім еритроцити тричі відмивають у Приклад 2 Юмл фізіологічного розчину, забуференого 1/15М По запропонованому способу отримано по фосфатним буфером рН 7,2 і доводять до 2% кон500мл тривалентного, чотиривалентного і пятивацентрації наповнювачем, що складається з фізіолентного лептоспірозного еритроцитарного діагнологічного розчину, забуференого фосфатним бустикумів для перевірки їх чутливості фером рН 7,2, 1% нейтрального формаліну та 0,4% нормальної сироватки кролика Отриманий Чутливість перевіряли в реакції непрямої гезапропонованим способом полівалентний еритромаглютинації з гомологічними серогрупоспецифічцитарний діагностикум розливають і закупорюють ними та родоспецифічними сироватками по ВІДОв ампули по 5мл МІЙ методиці [7] Результати перевірки приведені в таблиці Винахід підтверджується конкретними прикладами Приклад 1 Вирощену і відмиту біомасу лептоспір Вайнберг, Москва-5, Помона ресуспендують фізіологічТаблиця Чутливість полівалентних лептоспірозних еритроцитарних діагностикумів по відношенню до серогрупових і родоспецифічної антилептоспірозних сироваток в титрах антитіл Діагностикум Імунні антилептоспірозні сироватки Серогрупи Іктерогеморапя 3-х валентний 4-х валентний 5-ти валентний Відомий Помона Гебдомадіс Грипотіфоза Каніколя 1 12800 1 12800 1 6400 1 6400 1 6400 1 12800 1 6400 Родоспецифічна лептоспірозна 1 25600 1 25600 1 12800 1 6400 1 6400 1 6400 1 12800 1 25600 0 0 0 0 0 1 1600 Із приведених даних видно, що полівалентні лептоспірозні діагностикуми значно активніші (в 16 разів) ніж відомий Крім того, полівалентні діагностикуми визначають серогрупові антитіла в серогрупових сироватках, які не визначає відомий пре парат Таким чином запропонований спосіб дає можливість отримувати полівалентний лептоспірозний еритроцитарний діагностикум значно активніший від відомого моноантигенного (в 16 разів), збіль 5 45302 6 шити в 15 разів вихід цільового продуїсгу, скоротиетнологічний діагноз на 2 - 3 добу від початку зати в 16 разів затрати часу, зменшити матеріальні хворювання в любій мікробіологічній лабораторії, витрати і виключити 4 технологічні ланки з викорикрім того він забезпечує виявлення не тільки родостанням дефіцитних і коштовних реагентів сецифічних, але й серогрупо-специфічних антилеОтриманий діагностикум може найти широке птоспірозних антитіл практичне застосування, бо дає змогу поставити ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71