Спосіб одержання грипозного еритроцитарного діагностикуму

для СЛУЧСІ ьного ПОЛЬЗОВАНИЯ экз СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИН G 01 N 3 3 / 5 3 1 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР СІ напас • ( I т (21) 4679584/U (22) 14.04.89 ( 7 1 ; Одесский паучно-исследователь- ' ский институт вирусологии и эпидемиологии им. И.И,Мечникова, Одесское предприятие по производству бактерийных препаратов, Всесоюзный научно-исследовательский институт гриппа и Одесская городская клиническая инфекционная больница (72) А.Г.Стопчанская, А.Я-Гайдаренко, Э.П.Корнеева и В.Ф.Зеваков (53) 615.373(038.8) (56) Корнеева Э.И. и соавт. Лабораторный регламент получения диагностикума сухого типа А или B s 1977, ( 5 4 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГРИППОЗНОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО ДИАГНОСТИКУМА (5 7) Изобретение относится к области медицины. Цель изобретения - повышение специфичности и стабильности гриппозного эритроцитарного диагностикума. Эта цель достигается тем, что процесс сенсибилизации эритроцитов антигенами вируса гриппа с помощью хлорида хрома завершают в присутствии неионного детергента тритона х-100 и связавшийся с эритроцитами антиген стаби Изобретение относится к медицине и может быть использовано для .диагностики гриппа и оценки иммунологической эффективности гриппозных вакцин. Разработанный способ присоединения к эритроцитам поверхностных антигенов вируса гриппа и их стабилизации может быть использован в производственных условиях и при проведении экспериментапьных исследований. 31-91 лизируют формалином. При отсм достигается длительное сохранение пространственней структуры антигенов, комплементарных гомологичным антителам. Согласно изобретению способ осуществляется следующим образом. К t мл 50%-ного формалиниэированиых эритроцитов барана добавляют 8 мл физиологического растворам 1мл элюатавируса гриппа с титром гемагглютининов 1:512 1:2048, вносят 1 мл 0,3%-ного раствора хлорида хрома, смесь встряхивают и выдерживают 15 мин при 37 С, добавляют 10 мл 0^01%-ного раствора тритона х-100 (конечная концентрация 0,005%), центрифугируют 5 мин и из осадка эритроцитов готовят 5%-ную взвесь, которую обрабатывают раствором формалина в конечной концентрации 0 S 05%. Полученный по предлагаемому способу препарат обладает высокой специфичностью и стабильностью, может быть использован для серологической диагностики гриппа и оценки иммунологической эбзфективности гриппозных вакцин. Предлагаемый способ может быть использован в производственных условиях. 3 табл. Целью изобретения является повышение специфичности и стабильности гриппозного эритроцитарного диагностикума Способ осуществляют следующим образом. Готовят формалинизированные эритроциты барана по известной методике. К 1 мл 50%-ных формалинизированных эритроцитов барана добавляют 8 мп Физиологического раствора и 1 мл элюата Р С 672825 вируса гр.їппа с титром гемдгглютипинов 1:512-1:2043, получаемого а д сорбцией-элюдней на формаликизнрованиык куриігьіх эритроцитах. Смесь тщательно перемешивают, добавляют 1 мл свежеприготовленного 0,3%-иого р а с т вора хлорида хрома и вновь тщательно перемешивают. Полученную суспензию выдерживают 15 мин при 37 С па яодяной бане, периодически в с т р я х и в а я . Зятем вносят 10 мл 0,01%-ного р а с т в о ра тритона х-100, приготовленного на забуфереином физиологическом раствора рН 7 , 2 . Полученную ЕЗЯЄСЬ тщательно перемешивают п центрифугируют при комнатной температуре Ь мин при 2000 об/чин. Из осадка эритроцитов готовят 5%-ную взвесь тіа (Ьизиологическом раствор* 3 и обрабатывают (Ьорма- 20 лином в конечной концентрации 0,05% в течение 1 ч . Эритроциты дважды отмывают фиіпологкческнм раствором, из осадка готовят 5%-ную взвесь сенсибилизированных притроцитов по сахарно- 25 пептоновой среде, состав ло^орой приведен в лабораторном регламенте, и лиофилыю высушивают. Концентрация формалина может варштрова'ться от 0,1 до 0,01% без существенного влияния 30 на специфичность и чувствительность получаемого эрптроцитарчого днагностикума. Из данных табл. 1 и 2 видно, что при связывании лируса гриппа А--Ленинград 83 (НЗЫ2) хлоридом хрома без обработки тритоном х-100 получаемый эритроцитарный дпагностикум выявлял антитела в коммерческой и специфической сыворотке в титре 1:320, тогда ,Q как после допошштепыюй обработки взвеси раствором тритона х-100 препарат выявлял противогриппозные а н т и т е ла в этой же сыворотке в титре 1:12801:2560, При этом специфичность препа 45 рата также возрастала. Из данных табл. 2 с л е д у е т , что получаемый в присутствии тритона х-100 препарат выявлял специфические 'антитела з 64 раза более чктивно, 50 чем гетерологичные, тогда как присоединение вируса гриппа только с п о ЕЮЦЫО хлорида хрома обеспечивало получение менее специфичного препар а т а . ПОСГЇРДНІІЙ выявлял гєтерологчч-і ные антитела усего в 4-16 рач менее активно, чем гомологичные» Таким образом, дополнительна», обработка на заключительном этапе сенсибилизации тригоком х-100 повышает не только чувствительность, но и специфичность гриппозного эритроцитарного диагностикума. С целью усиления фиксации присоединенного антигена и стабилизации пространственной структуры антигенных детерминант препарат после окончания сенсибилизации обрабатывают 0905%~ным формалином. При этом без уменьшения чувствительности препарата в 8-20 раз снижается уровень неспецийшчаскшг реакций (см. т а б л . 3 ) . Таким образок, способ обеспечивает содержание в предлагаемом препарате такого количества ссроподтипа вируса As которое позволяет выявлять с п о мощью РТГА в коммерческой гомологич" 1 ! о й сыворотке антитела в титре 1:6401:2560 при титре антител в РТГА 1:160— 1:320. П р и м е р 1. Вируссодержащую аллантоисную жидкость вируса гриппа (Хабаровск 74/77 (II1N1) или А (Чили) 1/83(H1N1> поручают заражением 10-, 11-дневных куриных эмбрионов, которые культивируют в течение 72 ч при 35,5°С. Формалинизированные эритроциты кур тршеды отмывают физиологическим р а с т вором и из осадка -эритроцитов готовят 50%-ную суспензию в этом же р а ство ре, добавляют вируссодержащую аллантоисную жидкость вируса гриппа D количестве 10 мп на 1 rut 50%-ной суспензии эритроцитов. Взвесь тщательно перемешивают п оставляют на ночь (16-18 ч ) -при 4°С, затем центрифугируют 15 мин при 2000 об/мин и 4°С. Над осадок о т брасывают, осадок ресуспенэируют в 3,5%-ном растворе NaCl, количество которого в 10 р а з меньше, чем количество добавленной вирусеодержащей жидкости. ВЗЕЄСЬ тщательно перемешивают и помещают на водяную баню при 37 °С на 2;5 ч9 центрифугируют 15 мин при 2000 об/мин, нлдосадок (элюат) собирают ^ определяют в нем титр г е Мс'гглютиншюп. Форма-шнпзированные ?тэитроциты барана трижды отмывают физиологическим раствором, готовят 50%~кую суспензию эритроцитов в этом же р а с т в о р е , К 1 чл указанной суспензии добавляют 8 мгї Физиологического раствора и 1 мг. .элюата вируса грігапа с титром гемаггліотішннов 1: 5 і 2-1:20^8 ( смесь тщательно перемешивают и добавляют 1 мл свежеприготовленного 1672825 0,3%-ного раствора хлорида хрома и вновь тщательно перемешивают. Полученную суспензию выдерживают 15 мин при 37'С на водяной бане, периодически встряхивая (каждые 3-5 мин). Затем вносят 10 мл 0,01%-ного раствора тритона х-100, приготовленного на забуференном физиологическом растворе рН 7,2, смесь тщательно пе- 10 ремешивают и центрифугируют при комнатной температуре 5 мин при 2000 об/мин. Из осадка эритроцитов готовят 5%-ную взвесь на физиологическом растворе и обрабатывают форма- 15 лином в конечной концентрации 0,05% в течение 1 ч . Взвесь центрифугируют 15 мин при 2000 об/мин и полученный осадок дважды отмывают сЬизиологичес20 ким раствором. Из осадка готовят 5%-ную в з в е с ь сенсибилизированных антигенами вируса гриппа эритроцитов в сахароэо-пептоновой с р е д е . Для ее приготовления 10 г сахарозы растворяют в 199 мл 6,5%-ного раствора пепто- 25 на. Полученную в з в е с ь эритроцитов р а з ливают в ампулы по 1 мл и высушивают в камерах ТГ-15; длительность сушки 48 ч . Определяют специфичность и ч у в ствительность полученного диагностикума. 6 Таким образом, способ получения гриппозного эритроиитарного диагностикума обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества: способность препарата ди&ференцировать антитела к серолодтипам вируса. гриппа А и не д а в а т ь перекрестных реакций с серотипом В, что в силу особенностей РТГА позволяет быстро устанавливать сероподтип эпидемического вируса в любой лаборатории; стабильность пространственной структуры специфических антигенов в т е ч е н и е двух лет хранения препарата; исключение посредника с канцерогенными свойствами и предварительного этапа определения оптимальной дозы посредника . Препарат может быть использован в практике здравоохранения для диагностики гриппа и определения сероподтипа эпидемического вируса гриппа А. Разработанный способ присоединения вируса гриппа может быть применен в производстве гриппозных диагностикумов и научных исследованиях. Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я і Способ получения гриппозного эритроцитарного диагностикума» включающий присоединение вируса гриппа к формалшшзированным эритроцитам барана П р и м е р 2 . Выполняют те же опес помощью химического посредника, рации, что и в примере 1, за исклюо т л и ч а ю щ и й с я тем, ч т о , с чением т о г о , что используют вируссоцелью повышения специфичности и с т а держаптую аллантоисную жидкость вируса 35 бильности препарата, присоединение гриппа A(H3N2) - штамм А (Ленинград) осуществляют с помощью 0,03%-ного ра289/83. Представлены сравнительные створа хлорида хрома и сенсибилизацию результаты определения специфичности завершают в присутствии 0,005%-ного и чувствительности двух серий, полураствора тритона х-100 в течение 5мин, 40 ченных по предлагаемому методу грипсвязанный с эритроцитами антиген фикпозных эритроцитарных диагностикумов, сируют 0,05%-ным раствором формалина хранившихся в течение 2 л е т . в течение 1 ч . Т а б л и ц а 1 Чувствительность гриппозного эритроцитарнтго д и а г ностикума, получаемого с помощью хлорида хрома и тритона х-100 Эритроцитарный препарат Формалинизированные эритроциты, сенсибштизированные вирусом Титр противо-' Контроль гриппозных антител (коммерческая антисыворотка к вирусу гриппа A0I3N2), ( с е рия 214 1672825 , Продолжение ' габл.1 \ Титр прошво-- Контроль гриппозчых антител (коммерческая антисыворотка к вирусу гриппа A(H3N2), серия 214 Эритроцитарный препарат гриппа А(Ленинград) 289/83 (H3N2) с помощью хлорида хрома (серия 1) 1:320 0 Формалннизированные эритроциты, сенсибилизированные вирусом гриппа А(Ленинград)239/83 (H3N2) с помощью хлорида хрома (серия 2) 1:320 0 Формалинизированньіе эритроциты, сенсибилизированные вирусом гриппа А(Ленинград)289/83 (H3N2) с помощью хлорида хрома и тритона х~100 (серия 3) 1:1280 0 Формалииизированные эритроциты, сенсибилизированные вирусом гриппа А(Ленинград)289/83 (H3N2) с помощью хлорида хрома и тритона х-100 (серия 4) 1:1280 0 Т а б л и ц а 2 Специфичность гриппозного эритроцитарного диагностикума, приготовленного из вируса А(Ленинград)289/83(НЗМ2) с помощью хлорида хрома и тритона х-100 Эритроцитарные препараты, полученные с помощью Титр противогриппозных антител в антисыворотках к вирусам гриппа A(H3N2) серия 214 A(H1N1) серия 223 A(H2N2) серия 217 В серия 21 Хдорида хрома 1:320 0 1:20 1:80 Хлорида хрома и тритона х-100 1:2560 1:40 1:40 Влияние Формалина на стабильность свойств гриппозного диагпостикума Эритроцитарный лизгностикум из штамма А(Ленинград)289/83 Т а б л к ц а З эрлтроцитариого Титр противогриппозных антител в антисыворотках к вирусам гриппа А(НСШ) A ( H 1 N 1 ) J A 2 ( H 2 H 2 ) J A ( H 3 N 2 ) [ Бет обработки Лормалином С обработкой 0,052-ным раствором Аормалина 1:20 Ъ |КОНТ Роль 1:329 1:2560 1:120 0 1:40 1:2560 1:А0 0 1672825 Редактор Т.Иванова Составитель Г.Крюкова Техред м.Дидык Корректор М.Самборская Заказ 3330/ДСП Тираж 289 Подписное БНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. А/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101