Спосіб первинного відбору біологічно активних речовин

Спосіб первинного відбору біологічно активних речовин, що включає змішування дослідної речовини з реплікуємим об'єктом, його реплікацію та визначення наявності або відсутності реплікату, який відрізняється тим, що як об'єкт, який реплікується, використовують ДНК або РНК інфекційних агентів, реплікацію здійснюють методом полімеразної ланцюгової реакції, а наявність або відсутність реплікату визначають електрофорезом і при відсутності реплікату роблять висновок про наявність біологічної активності Винахід відноситься до експериментальної медицини та фармакології і може бути використано для визначення біологічної активності ХІМІЧНИХ сполук Найближчим, з відомих заявникові, є спосіб у ВІДПОВІДНОСТІ до якого відбирали моно шар клітин, які попередньо відмивали розчином Хенкса, і вносили вірус простого герпесу у дозі ЮОТЦРбог/мл Після 1,5 годинної адсорбції при 37°С вірус виділяли відмиванням живильним середовищем 199 і в культуру клітин додавали дослідну речовину в концентрації 5мг/мл Вірус-специфічну цитопатичну дію оцінювали кожен день по загальноприйнятому методу Про біологічну антивірусну активність дослідної речовини судили по зниженню інфекційного титру вірусу в порівнянні з контрольними культурами (див Die Pharmazie -2000 -V11 -10 -Р 733 - 736 - Biological active acndme derivatives Part 4 Synthesis and antiviral activity of some bisacndmilated diamides//S A Lyakhov et all) Даний спосіб обраний прототипом Прототип збігається з винаходом, що заявляється, у наявності спільних ознак змішування дослідної речовини з об'єктом, що реплікується (у прототипу таким об'єктом є вірус простого герпесу), реплікація об'єкту, визначення наявності реплікату Але, спосіб-прототип має рад недоліків, до яких відноситься відносна небезпечність (тому, що об'єктом, що реплікується, є вірус), необхідність підтримання життєздатності культури клітин для подальшого зараження їх вірусом, що потребує спеціального обладнання, дорогих і дефіцитних реактивів і додержання протиепідемічного режиму, а також неможливість досконалого виявлення механізмів противірусної активності дослідного препарату і досить тривалий час дослідження В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб первинного відбору біологічно активних речовин, в якому за рахунок заміни об'єкту, що реплікується, а також методу реплікації і визначення реплікату, забезпечити безпечність досліджень, можливість досконалого вивчення механізмів противірусної дії дослідних сполук, зменшення витрат, спрощення та скорочення процедури відбору Поставлена задача вирішена в способі первинного відбору біологічно активних речовин, що включає змішування дослідної речовини з реплікуємим об'єктом, його реплікацію та визначення наявності або відсутності реплікату тим, що, як об'єкт, що реплікується, використовують ДНК або РНК інфекційних агентів, реплікацію здійснюють методом полімеразної ланцюгової реакції, а наяв 00 ю 45820 чого буфера для електрофорезу В мірну колбу на ЮООмл вносили вміст флакону з буфером для електрофорезу (ТВЕ), доводили до мітки дистильованою водою і ретельно перемішували до повного розчинення осаду Після готували 1,5%-й агарозний гель, вміщували його в конічну колбу і додавали 15мкл броміду етідію, обережно перемішуючи Розтоплену агарозу охолоджували до 50°С і заливали на платформу з гребінкою товщиною шару ~ 4мм Після застигання обережно виймали гребінку, а платформу переносили в електрофоретичну камеру і заливали 800мл буфер ТВЕ так, щоб він укривав гель шаром ~3 - 4мм Далі 15мкл продукту ампліфікації змішували з 5мкл барвника (бромфеноловий синій) Електрофорез проводили 25хв при 80 100В, та кімнатній температурі Після сеансу електрофорезу агарозний гель поклали на екран УФ-трансілюмінатора і визначали наявність реплікату В агарозному гелі смужка жовтого кольору не з'явилася Це свідчить про відсутність реплікату, тобто досліджуєма речовина має біологічну активність Одержані дані співпадають з результатами вивчення противірусної активності досліджуємої речовини, які викладені у статті Lyakhov S А , Suveyzdis Y І , Litvmova L А, Andronati S А, Rybalko S L, Dyadyun S T Biological active acndme denvates Part 4 Synthesis and viral activity of new bis-acndmes Die Pharmazie, 2000, 55, №10, 734 - 736 Зокрема, у вказаній роботі показано, що 2(акридин-9-іламіно)-г\І-{5-[2-акридин-9-іламшо)-3метил-бутиріламіно]пентил-3-метил-бутираміду знижує інфекційний титр вірусу до 1, у контролі він дорівнює 6 Відомо, ЩО речовина вважається активною, якщо знижує інфекційний титр вірусу більше ніж на 1,5 - 2 одиниці Таким чином, одержані дані підтверджують наявність у 2-(акридин-9-іламшо)-г\І-{5-[2-акридин9-іламіно)-3-меттил-бутиріламіно]пентил-3-метилбутираміду біологічної активності, конкретнопротивірусної Приклад 2 Проводили визначення біологічної активності г\І,г\І1-діакридин-9-ілгексан-1,6-діаміну Для цього 5мкл вказаної речовини вмістили у пробірку, змішали II з об'єктом, що реплікується (РНК вірусу простого герпесу І типу, штам Л2) і Після введення ДНК збудника утворилася здійснювали реплікацію методом полімеразної стійка трифазна система, поділена на верхню і ланцюгової реакції, після чого визначали наявність нижню фази Пробірку установлювали у термостат або відсутність реплікату електрофорезом, як опиі нагрівали до 65°С, при цьому віск розтоплювався сано у Прикладі 1 і підіймався уверх, а верхня і нижня фази перемішувалися Після ЦЬОГО проводили ампліфікацію Визначення показало, що у агарозному гелі багатократне збільшення числа копій специфічної з'явилася смужка жовтого кольору Це свідчить ділянки ДНК, каталізуємої ферментом ДНК - поліпро наявність реплікату, а значить речовина, яка меразою (Taq-полімераза) Ампліфікацію проводосліджується не має біологічної активності дили в слідуючому режимі спочатку 4 хвилини при Одержані дані співпадають з результатами 95°С - один цикл, 1хв при 95°С, 1хв при 67°С, 1хв вивчення противірусної активності даної речовини, при 72°С - ЗО циклів, 2хв при 72°С - один цикл, які викладені у статті Lyakhov S А , Suveyzdis Y І , після чого зразок охолоджували до + 4°С і зберігаLitvmova L А, Andronati S А, Rybalko S L, ли при даній температурі Dyadyun S T Biological active acndme denvates Part 4 Synthesis and viral activity of new bisНаявність або відсутність реплікату визначали acndmes Die Pharmazie, 2000, 55, №10, 734 - 736 електрофорезом Для цього спочатку приготували розчин робоЗокрема, у вказаній роботі показано, що N,N1 ність або відсутність реплікату визначають електрофорезом і при відсутності реплікату роблять висновок про наявність біологічної активності Новим у винаході, що заявляється, є те, що як об'єкт, що реплікується, використовують ДНК або РНК інфекційних агентів, реплікацію здійснюють методом полімеразної ланцюгової реакції, наявність або відсутність реплікату визначають електрофорезом Таким чином, замість вірусу використовують ДНК або РНК збудників інфекційних захворювань як об'єкти, що реплікуються Це забезпечує безпечність досліджень Здійснення реплікації методом полімеразної ланцюгової реакції дозволяє досконаліше вивчити механізми дії дослідних сполук, а визначення наявності чи відсутності реплікату методом електрофорезу значно скорочує час дослідження Все це також зменшує витрати і спрощує процедуру дослідження Спосіб здійснюється слідуючим чином Речовину, яку перевіряють на біологічну активність, змішують з об'єктом, що реплікується - ДНК або РНК інфекційного збудника Після цього проводять реплікацію методом полімеразної ланцюгової реакції і визначають наявність або відсутність реплікату електрофорезом Якщо у агарозному гелі не має смужки жовтого кольору - це означає про відсутність в ньому реплікату, значить досліджуєма речовина має біологічну активність Поява в агарозному гелі смужки жовтого кольору свідчить про наявність реплікату і відсутності біологічної активності досліджуємої речовини Приклад 1 В пробірку вмістили 2,5мкл прямого та зворотного праймерів, 2,5мкл розчину дезоксинуклеозідтрифосфатів, наслоіли Юмкл розплавленого воску, так щоб він повністю покривав розчин На поверхню застиглого воску додали Юмкл ПЛРбуфер з Taq-полімеразою, поверх реакційної суміші наслоіли 20мкл мінеральної олії, щоб запобігти випаровуванню і зберегти стабільність об'єму розчину На олію додали 5мкл 2-(акридин-9іламіно)-г\І-{5-[2-акридин-9-іламшо)-3-метилбутиріламіно]пентил-3-метил-бутираміду та 5мкл позитивного контролю (тотальна ДНК вірусу простого герпесу І типу виділена з штаму Л2 методом фенольної екстракції і преціпітацм етанолом) 5 45820 6 діакридин-9-ілгексан-1,6-діамш знижує інфекційний що передаються статевим шляхом (НДЦЗПСШ) титр до 5, у контролі він дорівнює 6 Даним способом відібрані 18 нових речовин, Спосіб, що заявляється, апробовано в лабоякі синтезовані вперше, для подальшого скринінгу раторм Науково-дослідного центру захворювань, та фармакологічних досліджень ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044)456-20- 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71