Спосіб одержання біологічно активних речовин унгернії віктора ungernia victoris vved.ex artjuschenko

1. Спосіб одержання біологічно активних речовин унгернії Віктора Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko, який включає індукцію росту і вирощування біомаси культури клітин на штучному живильному середовищі з наступним виділенням біологічно активних речовин, який відрізняється тим, що використовують експланти цибулини дорослої рослини, попередньо витриманої при температурі +3-7°С 0,5-2 роки, культур у отримують і вирощують на агаризованому або в рідкому живильному середовищі наступного складу, мг/л: NH4NО3 400-600 KNО3 1000-1200 (NH4)2SО4 200-400 400-600 MgSО4×7H2 О 800-1000 Ca(NО3)2×4Н2О NH4H2PО4 500-700 (NH4)2HPО4 90-110 КСІ 60-80 KJ 0,8-0,9 0;2-0,3 Na2MoО4×2H2О 0,02-0,03 CuSО4×5H2О 0,02-0,03 СоСІ2×6Н2О 23-25 MnSО4×5H2 О Н3ВО3 5-8 7-9 ZnSО4×4H2О 27-28 FeSО4×7H2О Na2 ЕДТА (трилон Б) 37-38 тіамін 0,8-1,2 піридоксин 0,5-1,0 нікотинова кислота 0,5-1,0 гліцин 1,5-2,5 мезоінозит 80-100 1-нафтилоцтова кислота 1,8-2,2 A (54) СПОСІБ ОД ЕРЖАННЯ БІОЛОГІЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН УНГЕРНІЇ ВІКТОРА UNGERNIA VICTORIS VVED.EX ARTJUSCHENKO 42982 Винахід відноситься до галузі біотехнології і може бути використаний у медичній, харчовій та косметичній промисловості. Унгернія Віктора є джерелом одержання біологічно активних речовин, що здавна широко використовуються у традиційній тібетській медицині. В офіційній медицині унгернія Віктора є основним джерелом одержання алкалоїду галантаміну. Однак унгернія Віктора є рідкісним ендемічним видом, що зустрічається на Памірі (Південні схили Гіссарського хребта, Таджикистан). Альтернативним джерелом одержання біологічно активних речовин можуть бути культивовані клітини цієї рослини. Відомі способи одержання біологічно активних речовин із культивованих рослин, що включають індукцію росту і вирощування біомаси культури клітин на штучному живильному середовищі з наступним виділенням біологічно активних речовин [1, 2]. Розроблено такий спосіб для унгернії Віктора, який грунтується на одержанні штаму культивованих клітин Ungernia victoris, що здатен продукувати алкалоїди групи галантаміну і лікорину [3]. Однак цей штам є низьким за продуктивністю (ви хід сирої маси - 87-126 г/л, сухої маси 5-9,8 г/л, вміст суми алкалоїдів в перерахунку на суху біомасу – 0,042-0,051%) і не є джерелом одержання інших біологічно активних речовин, окрім незначної кількості алкалоїдів. Завданням винаходу є розробка способу одержання продуктивної культури клітин унгернії Віктора, біомаса якої є джерелом одержання біологічно активних речовин, що мають, зокрема, радіопротекторну та антимутагенну дію. Завдання вирішується розробкою способу введення в культуру in vitro , подальшого вирощування культивованих клітин на спеціально підібраному за складом живильному середовищі та одержанні з вирощеної біомаси біологічно активних речовин (субстанції). Одержують культур у клітин унгернії Віктора таким чином. Цибулину унгернії віком 15-20 і більше років, що знаходиться у стадії спокою, витримують у холодильнику при температурі +3-7°С протягом 0,5-2 років. Різні частини цибулини після стерилізації загальноприйнятими методами [2] висаджують на живильне середовище наступного складу, мг/л: NH4NО3 400-600 KNО3 1000-1200 (NH4)2SО4 200-400 400-600 MgSО4×7H2 О 800-1000 Ca(NО3)2×4Н2О NH4H2PО4 500-700 (NH4)2HPО4 90-110 КСІ 60-80 KJ 0,8-0,9 0,2-0,3 Na2MoО4×2H2О 0,02-0,03 CuSО4×5H2О СоСІ2 6Н2О 0,02-0,03 MnSО4 5H2О 23-25 Н3ВО3 5-8 7-9 ZnSО4×4H2О 27-28 FeSО4×7H2О Na2 ЕДТА (трилон Б) 37-38 тіамін 0,8-1,2 піридоксин 0,5-1,0 нікотинова кислота 0,5-1,0 гліцин 1,5-2,5 мезоінозит 80-100 1-нафтилоцтова кислота 1,8-2,2 кінетин 1,0-1,2 гідролізат казеїну 500-600 сахароза 50 000-60 000 агар 0,6-0,8% рН до автоклавування 5,8-6,2 шляхом екстракції 45% спиртововодним розчином із вирощеної клітинної біомаси отримують субстанцію, що має біологічну активність, яка визначається за критеріями радіопротекторної та антимутагенної дії. Спосіб одержання біологічно активних речовин унгернії Віктора Ungernia victoris Vved. ex Artjuschenko, згідно з винаходом, наступним методом, культуру клітин через 1,5-2 роки після отримання вирощують на агаризованому або в рідкому середовищі наступного складу: NH4NО3 400-600 KNО3 1000-1200 (NH4)2SО4 200-400 400-600 MgSО4×7H2 О 800-1000 Ca(NО3)2×4Н2О NH4H2PO4 500-700 (NH4)2HPО4 90-110 KCI 60-80 KJ 0,8-0,9 0,2-0,3 Na2MoО4×2H2О 0,02-0,03 CuSО4×5H2O 0,02-0,03 CoCI2×6H2О 23-25 MnSО4×5H2 O Н3ВО3 5-8 7-9 ZnSО4×4H2O 27-28 FeSО4×7H2O Na2 ЕДТА (трилон Б) 37-38 тіамін 0,8-1,2 піридоксин 0,5-1,0 нікотинова кислота 0,5-1,0 гліцин 1,5-2,5 мезоінозит 15-20 1-нафтилоцтова кислота 0,3-0,6 кінетин 0,02 гідролізат казеїну 40-60 сахароза 50 000-60 000 агар рН до автоклавування 5,8-6,2. Середовище розливають у пробірки або колби і стерилізують гарячою парою при 1 атм. 15-20 хвилин. Для пересадки використовують охололе середовище. Пробірки або колби з висадженими в асептичних умовах первинними експлантами ставлять у термостатоване темне приміщення (t°-24-26°С, відносна вологість повітря - 70-80%). Через 30-60 днів утворений на експлантах калюс відділяють і переносять на свіже живильне середовище того ж складу. В подальшому калюс пересаджують на свіже середовище на 55-65 день росту. Пасована калюсна тканина через 1,5-2 роки вирощування може бути перенесена на агаризоване або в рідке живильне середовище того ж складу зі зменшеною кількістю інозиту (до 20 мг/л), 1-нафтилоцтової кислоти (до 0,5 мг/л) кінетину (до 0,02 мг/л), гідролізату казеїну (до 50 мг/л). 2 42982 Пасована культура клітин представляє собою агреговану, середньої щільності калюсну тканину від світло-сірого до світло-жовтого кольору, як правило, без видимих ознак органогенезу із середнім темпом росту (індекс росту 4-7). Вихід сирої біомаси складає на 65 день росту 400-550 г з 1 г середовища, сухої біомаси - 20-35 г/л. Намагання отримати пасовану продуктивну культур у тканин чи клітин унгернії на інших за складом живильних середовищах були невдалими. Первинний калюс був отриманий і на інших за складом живильних середовищах, зокрема з мінеральною основою за Мурасіге-Скугом, ЛінсмаєрСкугом, Еріксоном (склад живильних середовищ див. [2]), що містили ті ж органічні добавки, що і в розробленому середовищі. Однак цей калюс протягом одного-двох років ріс дуже повільно і в подальшому загинув. Із сирої свіжозібраної клітинної біомаси готують настойку на 45° етиловому спирті. Співвідношення сировина : екстрагент складає 1:3. Результати біологічних випробувань настойки наведені в прикладах. Приклад 1 Визначення біологічної активності субстрату, отриманого із калюсної культури унгернії Віктора за критерієм зменшення числа гама-індукованих мікроядер в поліхроматофільних еритроцитах мишей. Мишей лінії СВА ´ C57BL6 (гібриди першого покоління) опромінюють гама-променями (доза 1,5 Гр при потужності опромінення 450 р/хв) в установці ГУПОС. Безпосередньо перед опроміненням експериментальним тваринам вводять перорально досліджувальний субстрат в дозі 0,2 мл на 1 тварину (10 мл на 1 кг живої маси). Приготування препаратів кісткового мозку, облік мікроядер в хроматофільних еритроцитах проводять за стандартною методикою [4] через 24 години після опромінення. Отримані результати представлені в табл. 1, з якої витікає, що досліджувальний субстрат зменшує рівень гама-індукованих мікроядер більше, ніж на 50%. Висновок: субстрат, отриманий із біомаси культивованих клітин, володіє біологічно активною дією, що виявляється в зменшенні числа гамаіндукованих мікроядер в поліхроматофільних еритроцитах кісткового мозку мишей. Приклад 2 Визначення біологічної активності субстрату, отриманого із калюсної культури унгернії Віктора за критерієм підвищення радіостійкості лабораторних тварин до високих доз радіації. Мишей лінії СВА ´ C57Bl6 (гібриди першого покоління) опромінюють гама-променями (доза 7,5 Гр при потужності опромінення 450 р/хв) в установці ГУПОС. Протягом 60 днів після опромінення, починаючи з першого дня, експериментальним тваринам вводять щоденно перорально досліджуваний субстрат в дозі 0,2 мл на 1 тварину (10 мл на 1 кг живої маси). Облік виживання мишей проводять щоденно протягом всього експерименту. Отримані дані представлені в табл. 2, з якої витікає, що досліджуваний субстрат знижує радіаційну загибель тварин майже на 50%. Висновок: субстрат, отриманий із біомаси культивованих клітин унгернії Віктора володіє біологічно активною дією, що виявляється в зменшенні радіаційної загибелі лабораторних тварин. Приклад 3 Визначення біологічної активності субстрату, отриманого із калюсної культури унгернії Віктора за критерієм зменшення індукованих мутацій в тесті Еймса. Гістидинзалежний штам сальмонели Salmonella typhimurium TA98, що реєструє мутації зсуву рамки зчитування, обробляли стандартним мутагеном 2,4-диокси-4,5-диоксо-4,5,9,10-тетрагідро9,10-діазопіреном (ДДДТДП). В експерименті вносили в кожну чашку по 0,1 мл досліджуваного субстрату. Враховували кількість колоній ревертантів, які виникають внаслідок зворотних мутацій від ауксотрофності по гістидину до прототрофності. Антимутагенний ефект визначали за відсотком пригнічення (зменшення) числа індукованих модельним мутагеном ревертантних колоній. Отримані дані представлені в табл. 3, з якої витікає, що досліджуваний субстрат зменшує рівень індукованих хімічним мутагеном мутацій на 25%. Висновок: субстрат, отриманий із біомаси культивованих клітин унгернії Віктора володіє біологічно активною дією, що виявляється в пригніченні рівня індукованих мутацій в тесті Еймса. Джерела інформації 1. Р.Г. Бутенко. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения. В кн.: Культура клеток растений и биотехнология, М.: На ука, 1986, с. 3-20. 2. Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений. Киев: Наук. думка, 1980, 488 с. 3. Патент СССР № 18061188 А 3. МПК С12N5/04. Штамм культивируемых клеток растений Ungernia victoris - продуцент алкалоидов группы галантамина и ликорина // Александрова И.В., Гордонова Л.К., Тулакин В.Г., Усманов П.Д., Соложенкин П.М. - 30.03.1993, Бюл. № 12. 4. J.Heddle. A rapid in vitro test for chromosomal damage. Mutation Research, 1973, v.18, p. 187-190. 3 42982 Таблиця 1 Визначення біологічної активності субстрату, отриманого із біомаси культивованих клітин унгернії Віктора за критерієм зниження числа гама-індукованих мікроядер (МЯ) в поліхроматофільних еритроцитах кісткового мозку мишей Радіаційна обробка Вплив субстрату із біомаси клітин Без обробки Без обробки Гамма-випромінювання (1,5 Гр) Гамма-випромінювання (1,5 Гр) Число МЯ. % Без обробки Обробка субстратом (0,2 мл на 1 тварину) Без обробки Обробка субстратом (0,2 мл на 1 тварину) 2,87+0,56 2,31±0,78 37,1±1,31 15,9±0,83 Таблиця 2 Визначення біологічної активності субстрату, отриманого із біомаси культивованих клітин унгернії Віктора за критерієм виживання лабораторних тварин (мишей), опромінених субле тальними дозами радіації Радіаційна обробка Вплив субстрату із біомаси клітин Без обробки Без обробки Гамма-випромінювання (7,5 Гр) Гамма-випромінювання (7,5 Гр) Без обробки Обробка субстратом (0.2 мл на 1 тварину протягом 60 днів) Без обробки Обробка субстратом (0.2 мл на 1 тварину протягом 60 днів) Частка тварин, що вижили, % 100 100 27±3 51±1 Таблиця 3 Визначення біологічної активності субстрату, отриманого із біомаси культивованих клітин унгернії Віктора за критерієм зменшення індукованих мутацій в тесті Еймса Хімічна обробка Без обробки Без обробки ДДДТДП (500 мкг/год) ДДДТДП (500 мкг/год) Вплив субстрату із біомаси клітин Без обробки Обробка субстратом (0,1 мл на чашку) Без обробки Обробка субстратом (0,1 мл на чашку) Число колоній - ревертантів, М±т 23±0,9 21+1,0 775±57,8 580±4,7 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2002 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ __________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 __________________________________________________________ 4