Спосіб визначення впливу дефіциту вітаміну в1 на реакцію постсинаптичної мембрани на дію холіноміметика у синапсах діафрагмального м’яза миші

Спосіб визначення впливу дефіциту вітаміну В1 на реакцію постсинаптичної мембрани на дію 3 під дією карбахолу, який є структурним аналогом ацетилхоліну, що не піддається гідролізу, і за їхніми відхиленнями від норми визначають вплив дефіциту вітаміну В1 на реакцію постсинаптичної мембрани до холіноміметику. Спосіб здійснюється наступним чином. Для дослідження ефектів аліментарного дефіциту вітаміну В1 використовують молодих мишей-самців з початковою вагою 10-12г. Тварин ділять на три експериментальні групи. Для запобігання канібалізму та копрофагії кожну тварину розміщують в індивідуальній клітці з сітчастою підлогою при температура 23±1°С. Тварини контрольної групи отримують синтетичну тіаміноконтрольну дієту, яка містить 67,6% вуглеводів, 18% білків, 8% ліпідів, вітаміни та мінеральні солі, без обмежень в кількості вжитої дієти. До складу синтетичної дієти входять казеїн, вільний від вітамінів - 18,00%, DLметіонін - 0,3%, холін хлорид - 0,1%, целюлоза 1,5%, сахароза - 67,6%, соняшникова олії рафінована - 8,00%, сольова суміш - 4%, вітамінна суміш - 0,5%. Сольова суміш містить NaCl - 13,9325%; КН2РО4 - 38,8967%; MgSO4*7H2О - 5,7302%; СаСО3 - 38,1442%; FeSO4*7H2O - 2,6960%; КІ 0,0790%: MnSO4*H2О - 0,4453%; ZnCl2 - 0,0259%; CuSO4*5H2O - 0,0475%; СоСl2*6Н2О - 0,0022%. Вітамінна суміш містить (в мг/кг дієти): тіаміна гідрохлориду - 16мг; рибофлавіну - 8,0мг; нікотинової кислоти - 50,0мг; кальція пантотенату - 40,0мг; фолієвої кислоти - 2,0мг; пара-амінобензойної кислоти - 100,0мг; інозитолу - 100,0мг; вітаміну В120,03мг; пірідоксина гидрохлориду - 5,0мг; біотину 0,4мг; менадіону - 5,0мг; аскорбінової кислоти 200,0мг; сахарози - до 5,0г. Вітаміни А в кількості 20000МЕ/кг дієти, Д - 2000МЕ/кг дієти та Є 100,0мг/кг дієти окремо розчиняють в олії перед додаванням останньої у раціон. Перед додаванням у харчовий раціон казеїн прогрівають при 140°С протягом 3 годин. Тварини контрольної групи з аліментарним обмеженням отримують таку ж синтетичну тіаміноконтрольну дієту, як і тварини контрольної групи, однак добову кількість дієти, отримувану кожною твариною цієї групи, обмежують, виходячи з добових потреб в їжі у тварин тіамінодефіцитної групи на ідентичних строках утримання. Такий підхід дозволяє чітко розрізнити власне наслідки дефіциту вітаміну В1 від можливого впливу анорексії, що розвивається при нестачі в організмі цього вітаміну. Тварини тіамінодефіцитної групи отримують без обмежень синтетичну тіамінодефіцитну дієту, ідентичну попередній за складом та способом приготування, але до неї не включають тіамін. Для дослідження ефектів антагоністу вітаміну В1 піритіаміну використовують мишей-самців віком 3-3,5 місяці масою 26-28г, яких забезпечують без обмежень стандартним раціоном віварію. Тварин ділять на експериментальну та контрольну групи. Піритіамін («Sigma», США) уводять мишам експериментальної групи одноразово внутрішньоочеревинно в дозі 100мг/кг маси тварини в 0,2мл 0,9% розчину NaCl. Тваринам контрольної групи внутрішньоочеревинно одноразово уводять 0,2мл 0,9% розчину NaCl. 46701 4 Для дослідження ефектів антагоністу вітаміну B1 окситіаміну використовують мишей-самців віком 3-3,5 місяці масою 26-28г, яких забезпечують без обмежень стандартним раціоном віварію. Тварин ділять на експериментальну та контрольну групи. Окситіамін «Sigma», США) уводять мишам експериментальної групи одноразово підшкірно в дозі 400мг/кг маси тварини в 0,2мл 0,9% розчину NaCl. Ураховуючи кислу реакцію розчину окситіаміну, після приготування його рН доводять до значення 7,3-7,4 шляхом додавання NaOH. Тваринам контрольної групи підшкірно одноразово уводять 0,2мл 0,9% розчину NaCl. Стерільність усіх використовуваних розчинів при їх уведенні тваринам забезпечують використанням фільтрів Millex-G5 («Millipore Corporation», США) з діаметром пори 0,22мкм. Як об'єкт досліджень використовують ізольовані френіко-гемідіафрагмальні препарати. Препарат монтують в плексигласовій ванночці, через яку з постійною швидкістю пропускають насичений карбогеном (95% О2 та 5% СО2) розчин Кребса такого складу (ммоль/л): NaCl - 137,0; КСl - 5,0; NaHCO3 - 11,0; NaH2PO4 - 1,0; СаСl2 - 0,5; MgCl2 3,25; глюкоза - 11,0. Досліди проводять при кімнатній температурі (20-21°С). Реєстрацію показників починають не раніше ніж за годину після завершення монтування препарату в ванночці та початку подавання розчину Кребса. За допомогою стандартних скляних мікроелектродів, заповнених 3М КСl, внутрішньоклітинно реєструють зміни мембранного потенціалу м'язових волокон, що виникають у відповідь на швидке уведення до ванночки з препаратом агоніста нікотинових ацетилхолінових рецепторів карбахолу в кінцевій концентрації -5 5*10 г/мл. Мікроелектрод в цей час повинен знаходитися в області кінцевої пластинки, про що свідчить наявність синаптичних потенціалів. В кожному нервово-м'язовому препараті досліджують по декілька м'язових волокон. Отримані показники усереднюють для кожної експериментальної групи та порівнюють між собою. Прикладом конкретного використання способу, що пропонується, є дослідження постсинаптичної чутливості в синапсах френікогемідіафрагмальних препаратів, отриманих від мишей контрольної та тіамінодефіцитної груп на 20-й день споживання тваринами відповідних синтетичних раціонів, від контрольної та експериментальної груп через 1,5 години після уведення тваринам піритіаміну, від контрольної та експериментальної груп через 3 години після уведення тваринам окситіаміну. В синапсах френіко-гемідіафрагмальних препаратів, отриманих від тварин тіамінодефіцитної групи, деполярізація постсинаптичної мембрани під впливом карбахолу становила в середньому 6,6±0,3 мВ (24 м'язових волокна, 7 препаратів), а відповідної контрольної групи - 7,2±0,2 мВ (21 м'язове волокно, 7 препаратів), причому ці дані не відрізнялися статистично достовірно. В синапсах френіко-гемідіафрагмальних препаратів, отриманих від тварин, яким було уведено піритіамін, деполярізація постсинаптичної мембрани під впливом карбахолу становила в середньому 6,8±0,3 мВ 5 46701 (24 м'язових волокна, 7 препаратів), а відповідної контрольної групи - 7,1±0,3 мВ (23 м'язових волокна, 7 препаратів), причому ці дані не відрізнялися статистично достовірно. В синапсах френікогемідіафрагмальних препаратів, отриманих від тварин, яким було уведено окситіамін, деполярізація постсинаптичної мембрани під впливом карбахолу становила в середньому 7,5±0,3 мВ (24 м'язових волокна, 7 препаратів), а відповідної контрольної групи - 7,4±0,4 мВ (25 м'язових волокон, 7 препаратів), причому ці дані також не відрізнялися статистично достовірно. Разом з тим, середня амплітуда мініатюрних потенціалів кінцевої пластинки, зареєстрована в синапсах френіко-гемідіафрагмальних препаратів, отриманих від мишей тіамін-дефіцитної групи на 20-й день споживання тіамінодефіцитної дієти, а також від мишей через 1,5 години після уведення ним піритіаміну, була статистично достовірно меншою порівняно з контролем [7, 8]. Для порівняння, середня амплітуда мініатюрних потенціалів кінцевої пластинки, зареєстрована в синапсах френіко-гемідіафрагмальних препаратів, отриманих від мишей через 3 години після уведення ним окситіаміну, не відрізнялася статистично достовірно від контролю [8]. Відсутність змін чутливості постсинаптичної мембрани до карбахолу дозволяє зробити висновок, що зменшення амплітуди мініатюрних потенціалів кінцевої пластинки як під впливом аліментарного дефіциту вітаміну Вь так і під впливом піритіаміну, обумовлено переважно пресинаптичними механізмами (змешенням кількості молекул трансмітера в окремих синаптичних везикулах). Таким чином, запропонований спосіб дає можливість досліджувати в умовах експерименту чутливість постсинаптичної мембрани до дії трансмітера у синапсах скелетних м'язів при дефіциті вітаміну В1, що дозволяє використовувати цей метод для широкого впровадження при проведенні досліджень, спрямованих на поглиблення уявлень про функціонування нервово-м'язової передачі та Комп’ютерна верстка Л. Купенко 6 шляхи реалізації біологічної активності вітаміну В і в організмі. Література: 1. Koike Н., Misu К., Hattori N., Ito S., Ichimura M, Ito H., Hirayama M., Nagamatsu M., Sasaki I., Sobue G. Postgastrectomy polyneuropathy with thiamine deficiency. // J Neurol. Neurosurg. Psychiatry. - 2001. - 71, N 3. - P. 357-362. 2. Маляревская А.Я. Обмен веществ у рыб в условиях антропогенного евтрофирования водоемов. - К.: Наук, думка, 1979. - 256с. 3. Barker J.N., Jordan F., Hillman D.E., Barlow O. Phrenic thiamin and neuropathy in sudden infant death // Annals New York Acad. Sci. - 1982. - 378. P. 449-452. 4. Szutowicz A., Tomaszewicz M., Bielarczyk H. Disturbances of acetyl-CoA, energy and acetylcholine metabolism in some encephalopathies // Acta Neurobiol. Exp. (Wars.). - 1996. - 56, N 1. - P. 323339. 5. Gibson G.E., Ksiezak-Reding H., Sheu K.F.R., Mykytyn V., Blass J. P. Correlation of enzymatic, metabolic and behavioral deficits in thiamine deficits and its reversal // Neurochem. Res. - 1984. - 9. - P. 803-814. 6. Nakagawasai O., Tadano Т., Hozumi S., TanNo K., Niijima F., Kisara K. Immunohistochemical estimation of brain choline acetyltransferase and somatostatin related to the impairment of avoidance learning induced by thiamine deficiency // Brain Res Bull. - 2000. - 52, N 3. - P. 189-196. 7. Романенко О.В., Шепелев С.Є. Вплив аліментарного дефіциту вітаміну В1 на спонтанне та викликане вивільнення трансмітера в нервовом'язових синапсах миші // Нейрофизиология / Neurophysiology. - 2008. - 40, №4. - С. 322-330. 8. Романенко О.В., Шепелев С.Є. Вплив антагоністів вітаміну В1 на синаптичну передачу в поперечносмугастому м'язі миші // Нейрофизиология / Neurophysiology. - 2008. - 40, №5/6. - С. 399-407. Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601