Спосіб визначення впливу аліментарного дефіциту вітаміну в1 на скоротливу активність діафрагмального м`яза

Спосіб визначення впливу аліментарного дефіциту вітаміну В1 на скоротливу активність діафрагмального м'яза, що здійснюють шляхом створення тіамін-дефіцитного стану, який відрізняє ться тим, що проводять реєстрацію показників скоротливої активності діафрагми і за їхніми відхиленнями від норми визначають вплив аліментарного дефіциту вітаміну В1 на функціонування діафрагмального м'яза. (19) (21) u200815110 (22) 29.12.2008 (24) 25.02.2009 (46) 25.02.2009, Бюл.№ 4, 2009 р. (72) ШЕПЕЛЕВ СЕРГІЙ ЄВГЕНОВИЧ, UA, РОМАНЕНКО ОЛЕКСАНДР ВІКТОРОВИЧ, UA (73) НАЦІОНАЛЬНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ О.О. БОГОМОЛЬЦЯ, UA 3 39574 льні групи. Для запобігання канібалізму та копрофагії кожну тварину розміщують в індивідуальній клітці з сітчастою підлогою при температура 23±1°С. Тварини контрольної групи отримують синтетичну тіамін-контрольну дієту, яка містить 67,6% вуглеводів, 18% білків, 8% ліпідів, вітаміни та мінеральні солі, без обмежень в кількості вжитої дієти. До складу синтетичної дієти входять казеїн, вільний від вітамінів - 18,00%, DL-метіонін - 0,3%, холін хлорид - 0,1%, целюлоза - 1,5%, сахароза 67,6%, соняшникова олії рафінована - 8,00%, сольова суміш – 4%, вітамінна суміш - 0,5%. Сольова суміш містить NaCl - 13,9325%; KН2РО4 38,8967%; MgSO4*7H2O - 5,7302%; СаСО3 38,1442%; FeSO4*7H2O - 2,6960%; KІ - 0,0790%: MnSO4*H2 O - 0,4453%; ZnCl2 - 0,0259%; CuSO4*5H2O - 0,0475%; СоСl2*6Н2О - 0,0022%. Вітамінна суміш містить (вмг/кг дієти): тіаміна гідрохлориду - 16мг; рибофлавіну - 8,0мг; нікотинової кислоти - 50,0мг; кальція пантотенату - 40,0мг; фолієвої кислоти - 2,0мг; пара-амінобензойної кислоти - 100,0мг; інозитолу - 100,0мг; вітаміну В12 0,03мг; пірідоксина гидрохлориду - 5,0мг; біотину 0,4мг; менадіону - 5,0мг; аскорбінової кислоти 200,0мг; сахарози - до 5,0г. Вітаміни А в кількості 20000МЕ/кг дієти, Д - 2000МЕ/кг дієти та Є 100,0мг/кг дієти окремо розчиняють в олії перед додаванням останньої у раціон. Перед додаванням у харчовий раціон казеїн прогрівають при 140°С протягом 3 годин. Тварини контрольної групи з аліментарним обмеженням отримують таку ж синтетичну тіамін-контрольну дієту, як і тварини контрольної групи, однак добову кількість дієти, отримувану кожною твариною цієї групи, обмежують, виходячи з добових потреб в їжі у тварин тіамін-дефіцитної групи на ідентичних строках утримання. Такий підхід дозволяє чітко розрізнити власне наслідки дефіциту вітаміну В1 від можливого впливу анорексії, що розвивається при нестачі в організмі цього вітаміну. Тварини тіаміндефіцитної групи отримують без обмежень синтетичну тіамін-дефіцитну дієту, ідентичну попередній за складом та способом приготування, але до неї не включають тіамін. Для дослідження скоротливої активності діафрагмального м'яза праву або ліву гемі діафрагму миші розміщують у плексигласовій ванночці об'ємом 7мл, через яку при температурі 20-21°С з постійною швидкістю 7мл/хв пропускають насичений карбогеном (95% О2 та 5% СО2) базовий розчин Кребса (БРК) такого складу (в ммоль на 1л): NaCl - 137,0, КСl - 5,0, NaHCO3 - 11,0, NaH2PO4 1,0, СаСl2 - 2,5, MgCl2 - 1,0, глюкози - 11,0. Реберний край гемідіафрагми закріплюють у ванночці, протилежний її край за допомогою капронової нитки з'єднують з важелем механотрона 6МХ1С. Препарат розтягують у ванночці таким чином, щоб була досягнута максимальна сила скорочень м'я за. Механічні рухи м'яза у відповідь на подразнення діафрагмального нерва трансформують за допомогою механотрону у електричні сигнали, які підсилюють та подають на вхід осцилографа або іншого реєструючого приладу. Діафрагмальний нерв постійно подразнюють надпороговими прямокутними імпульсами електричного струму три 4 валістю 0,1мс з частотою 2,67Гц, яка відповідає середній частоті дихальних рухів миші. Скорочення м'яза починають реєструвати не раніше ніж за годину з момента закріплення препарата у ванночці та початку подавання до неї БРК. Надійність нервово-м'язової передачі в препаратах оцінюють за індексом синаптичної депресії. Для цього БРК замінюють у ванночці з препаратом на модифікований розчин Кребса (МРК), що, на відміну від БРК, містить 0,5ммоль/л СаСl2 та 1,75ммоль/л MgCl2. Визначають силу скорочень м'яза у відповідь на подразнення діафрагмального нерва у БРК безпосередньо перед початком його заміни на МРК (перша реєстрація), через 25 хвилин після початку омивання препарату МРК (друга реєстрація), а потім після заміни у ванночці з препаратом МРК на БРК (третя реєстрація). Результати досліду використовують в подальших розрахунках, якщо сила скорочень м'яза під час третьої реєстрації відновлюється не менше ніж на 85% відносно першої реєстрації. В цьому випадку за даними першої та третьої реєстрації розраховують середню силу скорочень м'яза в БРК, приймаютьїї за 100% і нормують до неї силу скорочень м'яза в МРК. Отримані показники усереднюють для кожної групи та порівнюють між собою. Прикладом конкретного використання способу, що пропонується, є дослідження скоротливої активності діафрагмального м'яза на 10-й, 15-й та 20-й дні споживання піддослідними мишами відповідних синтетичних раціонів. Проведені спостереження продемонстрували відсутність у тварин тіаміндефіцитних гр уп вірогідних відмінностей середньої сили скорочень діафрагмального м'яза в БРК, що містив 2,5ммоль/л СаСl2 та 1,0ммоль/л MgCl2, порівняно з обома контрольними групами. Очевидно, в цих умовах рівень деполярізації, викликаний викидом ацетилхоліна у відповідь на подразнення нерва, залишався достатнім, щоб ініціювати потенціал дії м'язового волокна та скорочення останнього. Разом з тим, поглиблення дефіциту вітаміна В1 призводить до прогресивного зменшення амплітуди м'язових скорочень в МРК зі зниженим вмістом СаСl2 (0,5 ммоль/л) та збільшеним вмістом MgCl2 (1,75 ммоль/л). Вже на 10-й день споживання дієти середня сила скорочень діафрагмального м'яза в МРК, нормована до такої в БРК, у тварин тіамін-дефіцитної групи виявилась меншою майже на 30% порівняно з контрольною групою і на 27% порівняно з контрольною групою з аліментарним обмеженням. На 15-й день експерименту ці показники були меншими відповідно на 74% та 73%, на 20-й день - на 85% та 83%. Відмінності в усіх випадках мали вірогідний характер (Р