Спосіб лікування злоякісних пухлин, резистентних до хіміотерапії

Спосіб лікування злоякісних пухлин, резистентних до хіміотерапії, що включає проведення хіміотерапії з використанням препаратів платини, який відрізняється тим, що як похідний платини використовують цисплатин в ліпосомальній формі дозою 100 мг/м2 поверхні тіла. (19) (21) u200910194 (22) 08.10.2009 (24) 25.02.2010 (46) 25.02.2010, Бюл.№ 4, 2010 р. (72) ЧЕХУН ВАСИЛЬ ФЕДОРОВИЧ, ПІВНЮК ВАЛЕНТИНА МИХАЙЛІВНА, НОСКО МИХАЙЛО МИХАЙЛОВИЧ, ЛУК'ЯНОВА НАТАЛІЯ ЮРІЇВНА, ТОДОР ІГОР МИКОЛАЙОВИЧ, РУСЕЦЬКА НАТАЛІЯ ВІТАЛІЇВНА 3 47929 ментальних досліджень та 2-х історій хвороб пацієнтів. Протоколи експериментальних досліджень І. Об'єктами дослідження були клітинна лінія раку яєчнику А2780 та її сублінія, резистентна до цитотоксичного дії цисплатину - A 2780/DDP. Експресію поверхневих та внутрішньоклітинних антигенів вивчали за допомогою імуноцитохімічного методу, використовуючи мишачі моноклональні антитіла (МКАТ) до Р-Глікопротеїну (P-gp), глутатіон-S-трансферази (GST), РЕ, РП, Р53, Всl2, Е-кадгеринів, Кі-67, цикліну-D1, pRb, c-myc, p21(DakoCytomation, Данія) у стандартному розведенні [9]. Для визначення клітинного циклу з клітин лінії А2780 та її сублінії, резистентних до цитотоксичної дії цисплатину - A2780/DDP готували суспензію (1 млн клітин в 200мкл фізіологічного розчину хлориду натрію). Потім до суспензії додавали 2мл льодяного розчину 70% етилового спирту і фіксували клітини щонайменше 30хв. на льоду. Далі зразки центрифугували при 300хg протягом 5хв. і відбирали супернатант. Осад ресуспендували в 400мкл фізіологічного розчину хлориду натрію. Додавали 50мкл РНКази і 10мкл прорідію йодиду. Аналіз проб здійснювали на проточному цитофлуориметрі "Partec"(Germany) з використанням червоного фільтру [10]. В результаті імуноцитохімічного аналізу встановлено, що культивування клітин вихідної лінії А2780 з ліпосомальною формою цисплатину не викликає змін молекулярного профілю та перерозподілу клітин за фазами клітинного циклу. В протилежність цьому, культивування клітин A2780/DDP з ліпосомальною формою цисплатину призводило до зупинки клітин у фазі G 0/G1 та до зниження індексу проліферації. При цьому в резистентних до цисплатину клітинах лінії A2780/DDP під впливом ліпосомальної форми цисплатину також спостерігалось зниження експресії молекулярних маркерів апоптозу (р53 та Всl-2) та лікарської резистентності (GST та металотіонеїнів). Таким чином, нами доведено, що використання ліпосомальної форми цисплатину є найбільш ефективним по відношенню до клітин раку яєчника, резистентних до цисплатину. 4 II. Вироблення резистентності до цисплатину та всі дослідження проводились на лабораторних щурах - самицях Вістар масою 150±5гр. розводки віварію ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. На першому етапі тваринам, що досліджувались перевивали підшкірно на стегно 20% суспензію клітин карциноми Герена. Після чого тварин ділили на 2-і групи: контрольну та основну. Тваринам основної групи після досягнення пухлиною об'єму 0,5см3 починали проводити курс лікування цисплатином: 5 ін'єкцій через добу, внутрішньоочеревенно в дозі 1,2мг/кг. Тварин після закінчення курсу хіміотерапії забивали декапітацією під легким ефірним наркозом. З отриманих пухлин готували 20% суспензію пухлинних клітин, яку знову вводили новим групам тварин - контрольній та основній. Лікування в нових групах тварин проводили згідно описаній вище схемі. Тваринам було проведено проведено 27 курсів терапії цисплатином. Встановлено, що цисплатин гальмував ріст вихідної пухлини на 95-97%, а після 27 курсів лікування - 0-4% (був сформований резистентний фенотип). Дали всіх тварин з перещепленою карциномою Герену із сформованим фенотипом резистентності до цисплатину було поділено на 3 групи: перша (контрольна) яким вводили фізіологічний розчин, друга (дослідна) - яким вводили ліпосомальний цисплатин (ЗАТ «Біолік» (м. Харків), третя (2-й контроль) тварини, яким вводили вільний цисплатин. Введення цисплатину, фізіологічного розчину та цисплатину в ліпосомальній формі проводили після досягнення перевитою карциномою об'єму 0,3см3, в дозі 1,2мг/кг маси через день (всього 5 ін’єкцій, сумарна доза 6,0мг/кг). Після введення цитостатиків проводили вимірювання об'єму пухлини та розраховували відсоток гальмування росту пухлини в першій та другій групах в порівнянні з третьою групою (2-й контроль). Вимірювання об'єму пухлини проводили через день після кожного введення цитостатиків в динаміці. Результати експериментального дослідження по визначенню терапевтичної активності цисплатину в ліпосомальній формі в порівнянні із звичайним цисплатином в тварин з перещепленою резистентною до цисплатину карциномою Герена представлені в табл. 1. Таблиця 1 Показники об'єму пухлини та відсоток гальмування росту пухлини в тварин після проведення терапії вільної та ліпосомальної формою цисплатину. 3 Об'єм пухлини (см ) та відсоток гальмування росту пухлини (в дужках) Групи тварин 1-е вимірювання І - терапія вільним цис3,4±0,8 (+13%) платином II - терапія ліпосомаль3,7±1,1 (+23%) ним цисплатином III - контроль 3,0±0,4 2-е вимірюван- 3-е вимірюван- 4-е вимірюван- 5-е вимірювання ня ня ня 6,2±1,4 (-5%) 13,6±3,4 (-3%) 14,2±5,1 (-30%) 16,2±3,6 (-34%) 6,3±1,6 (-3%) 10,7±4,3 (-24%) 4,2±2,0 (-79%) 6,5±1,0 Таким чином нами експериментально доведено ефективність використання ліпосомальної фо 14,0±2,1 20,2±2,5 4,7±2,4 (-81%) 24,7±2,5 рми цисплатину при лікуванні резистентних до препарату пухлин карциноми Герена. 5 47929 Прикладами клінічного виконання способу можуть бути витяги з амбулаторних карт 2 пацієнтів. 1. Хвора Л., 1964 р. н., Амбулаторна карта № 1025/04. Діагноз: рак яєчників стадія 3с T3cN0M0. Стан після комплексного лікування, продовження хвороби - рецидив в малу миску. Клінічна група 2. Операція: надпіхвова ампутація матки з додатками, резекція чепця. ПГВ (№ 994-1011/03): серозна аденокарцинома яєчників, метастази в маткову трубу, в чепець. В ад'ювантному режимі хвора отримала сім циклів поліхіміотерапії за схемою «цисплатин з циклофосфаном» кожну 21 добу. Пройшла курс променевої терапії. В зв'язку з виникненням резистентності до цисплатину в 2006 році з'явився рецидив в малій мисці - прогресування хвороби. Тому для подолання резистентності проведено 2 курси поліхіміотерапії з включенням цисплатину в ліпосомальній формі (препарат «Ліпоплат», ліофілізований порошок для виготовлення розчину для ін'єкцій виробництва ЗAT "Біолік") у дозі 165мг (з розрахунку 100мг/м2 поверхні тіла) одноразово шляхом тривалої інфузії та циклофосфаном у дозі 1000мг. Курс лікування складався з 2-х введень хіміопрепаратів на 1-й та 21-й дні лікування. Вільний від лікування між введеннями інтервал тривав 3 тижні. Загальна виживаність - 24 місяці. 2. Хвора К., 1965 р.н., Амбулаторна карта №14653/05. Діагноз: рак яєчників стадія 3в T3вN0M0, канцероматоз очеревини, асцит. Клінічна група 2. Цитологія (№37924 від 29.10.2005): залозистий рак. Хвора отримала шість циклів поліхіміотерапії за схемою «цисплатин з циклофосфаном» кожну 21 добу. Пройшла курс променевої терапії. В зв'язку з виникненням резистентності до цисплатину в травні 2007 році з'явився рецидив в малій мисці (на фоні полі хіміотерапії), канцероматоз очеревини, метастази в пахові лімфатичні вузли, кахексія. Тому для подолання резистентності проведено 2 курси полі хіміотерапії з включенням цисплатину в ліпосомальній формі (препарат «Ліпоплат», ліофілізований порошок для виготовлення розчину для ін'єкцій виробництва ЗАТ "Біолік") у дозі 182мг (з 2 розрахунку 100мг/м поверхні тіла) одноразово шляхом тривалої інфузії та циклофосфаном у дозі 1000мг. Курс лікування складався з 2-х введень Комп’ютерна верстка А. Крулевський 6 хіміопрепаратів на 1-й та 21-й дні лікування. Вільний від лікування між введеннями інтервал тривав 3 тижні. Загальна виживаність - 31,5 місяці. Джерела інформації: 1. Go R.S, Adjei A.A. Review of the comparative pharmacology and clinical activity of cisplatin and carboplatin J. Clin. Oncol. - 1999: - № 17. P. 409-422. 2. Hill J.M., Speer R.J. Organo-platinum complexes as antitumor agents (review) Anticancer Res. - 1982: - № 2. P. 173-186. 3. Юрченко О.В., Тодор И.Н., Трындяк В.П. и др. Резистентность клеток карциномы Герена к цисплатину: биохимические и морфологические аспекты Эксперим. Онко. - 2003: - № 1. Р. 64-68. 4. Sharp S.Y., Rogers P.M., Kelland L.R. Transport of cisplatin and bisacelato-amminedichlorocyclohexylamine platinum(IV) (JM216) in human ovarian carcinoma cell lines: identification of a plasma membrane protein associated with cisplatin resistance Clin. Cancer. Res. - 1995: - № 1. P. 981989. 5. Shen D.W., Goldenberg S., Pastan I., et al. Decreased accumulation of [14C] carboplatin in human cisplatin-resistant cells results from reduced energy-dependent uptake J. Cell. Physiol. - 2000: - № 183. P. 108-116. 6. Ozols R.F. Treatment of recurrent ovarian cancer: increasing options - «recurrent» results J. Clin. Oncology - 1997: - № 6. P. 2177-2180. 7. Лившиц M.E., Максимов С.Я., Косников А.Г. Применение Элаксатина (Оксалиплатина) в лечении распространенного рака яичников. Биомедицинский журнал, 2001. - № 2. С. 207-208 (прототип). 8. Rennicke A.; Voigt W.; Mueller Т.. Resistance mechanisms following cisplatin and oxaliplatin treatment of the human teratocarcinoma cell line 2102EP Anticancer res. - 2005. - № 2 A. P. 11471155. 9. Chekhun V.F., Lukyanova N. Yu., Yurchenko O.V., Kulik G.I. The Role of Expression of the Components of Proteome in the Formation of Molecular Profile of Human Ovarian Carcinoma A2780 Cells Sensitive And Resistant to Cisplatin. Exp. Oncol, - 2005. Vol. 27. - № 3. P. 191-195. 10. Ormerod M.G. Flow cytometri-Handbooks, manuals, etc. II Series, - 2000. P. 277-278. Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601