Спосіб виявлення чутливості злоякісних пухлин до дії цисплатину

Спосіб виявлення чутливості злоякісних пухлин до дії цисплатину шляхом визначення протеолітичної активності, який відрізняється тим, що в плазмі крові визначають сумарну активність серинових протеїназ і у міру її підвищення судять про зниження чутливості злоякісних пухлин до дії цисплатину. (19) (21) a200505274 (22) 02.06.2005 (24) 15.09.2006 (46) 15.09.2006, Бюл. №9, 2006р. (72) Чехун Василь Федорович, Ковтонюк Оксана Володимирівна, Тодор Ігор Миколаєвич, Кулик Галина Іванівна (73) ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО НАН УКРАЇНИ (56) Osmak M, Vrhovec I, Skrk J. Cisplatin resistant glioblastoma cells may have increased concentration 3 білка, так і недоліком, адже зменшується інформативність про стан протеолізу в цілому. Найближчим аналогом до способу, що заявляється, є метод визначення концентрації окремих серинових протеїназ в резистентних до цисплатину злоякісних клітинах, цей аналог ми беремо за прототип [6]. Дослідження рівня двох серинових протеїназ - активатора плазміногену урокіназного типу (uPA) та інгібітора активатора плазміногену 1 типу (РАІ-1) проводили в культурі клітин гліобластоми людини з використанням імуноферментного методу (enzyme linked immunoabsorbent assay, ELISA) з застосуванням моноклональних антитіл. Було встановлене зростання концентрації даних серинових протеїназ в клітинах резистентного до цитостатику варіанту у порівнянні з чутливими клітинами. Але описаний спосіб є досить дорогим, оскільки потребує наявності відповідних антитіл, за допомогою яких визначають вміст окремих ферментів. Однак даний метод дозволяє визначати лише вміст ферментів, не даючи інформації про їх функціональну активність. Крім того, цей спосіб вимагає вміння роботи з культуральним середовищем і відповідно додаткового обладнання. В основу винаходу, що заявляється, поставлено задачу удосконалення способу виявлення чутливості злоякісних пухлин до протипухлинних препаратів шляхом визначення сумарного протеолітичного потенціалу для забезпечення більшої інформативності. Поставлена задача вирішується завдяки визначенню сумарної протеолітичної активності, як найбільш інформативного показника стану системи протеолізу, в плазмі крові. Суть винаходу полягає в тому, що визначення величини сумарної активності протеолітичних ферментів в плазмі крові свідчить про чутливість злоякісної пухлини до дії цисплатину, а саме по мірі підвищення протеолітичної активності, ступінь чутливості пухлини до дії цисплатину знижується. Удосконалення відомого способу вирішується за рахунок використання найбільш інформативного показника активності протеолітичної системи. Даний спосіб дозволяє виявляти ступінь лікарської резистентності, використовуючи плазму крові хворих. Оскільки в основі запропонованого способу виявлення чутливості лежить визначення сумарної протеолітичної активності в умовах in vivo, то це свідчить про більшу його об'єктивність. Спосіб, що заявляється, є високоінформативним, оскільки визначаючи сумарну активність протеїназ в плазмі крові, можна прогнозувати не лише ступінь чутливості пухлини до цисплатину, а й інтенсивність її метастазування, адже система протеолізу відіграє важливу роль в процесах інвазії пухлин та їх метастазування [10]. Суть способу, що заявляється, пояснюють приклади конкретного виконання: 76922 4 Приклад 1 Сумарну протеолітичну активність визначали в плазмі крові двох груп експериментальних тварин. Ці групи включали мишей з пухлиною, яка відрізнялася за ступенем чутливості до цитостатику. Паралельно досліджували інтенсивність метастазування пухлини. Тому для системного вивчення протеолітичної активності і метастатичного потенціалу пухлини було обрано модель солідної форми карциноми легені Льюіс (3LL). Саме ця модель пухлинного росту є класичною моделлю вивчення метастазування і вважається наближеною до клінічних форм. У кожній експериментальній групі було по 10 мишей-самців лінії С57В1/6 (2-2,5місячного віку з масою 18-20г). Тваринам прищеплювали внутрішньом'язево по 1,5 106 живих клітин карциноми Льюіс в 0,02мл середовища 199. Об'єктом дослідження була кров, яку стабілізували 3,8%-ним розчином цитрата натрію (Merck, Німеччина) в співвідношенні 9:1 і центрифугували при 1500об/хв протягом 10хв при t=4°C. Визначення сумарної протеолітичної активності (ПРА) в плазмі крові проводили спектрофотометричним методом, розробленим К.М. Веремєєнко [11]. В основі методу лежить визначення аргінінвмісних пептидів, які відщеплюються від лужного білка протамінсульфату протеолітичними ферментами плазми крові. За допомогою цьогометода вивчається ендогенна протеолітична активність плазми, яку проявляють протеїнази з трипсинподібною активністю і ферменти пептидазної дії. Активність нейтральних серинових протеїназ виражали в мкмоль аргініна/хв мл плазми. Результати, представлені в таблицях, подані у вигляді процентного співвідношення по відношенню до контролю, який приймали за 100%. Контролем слугувала плазма крові інтактних тварин. Цей метод вперше використали при дослідженні біохімічних особливостей перебігу лікарської резистентності. Він є досить інформативним, оскільки визначення сумарної протеолітичної активності в плазмі крові онкологічних хворих свідчить про активність процесів протеолізу в цілому, і тим самим може давати прогноз як інтенсивності метастазування, так і ступеня чутливості пухлини до дії протипухлинного препарату. Висновок про наявність лікарської резистентності робили за показниками гальмування росту пухлини після проведення хіміотерапії, показниками кінетики росту пухлини, за рівнем реакційноздатних сульфгідрильних груп у пухлинах та сироватці крові, за кількістю однониткових розривів ДНК у пухлинах та за даними ультраструктурних досліджень пухлин. Ступінь метастатичного ураження оцінювали за такими показниками, як середня кількість легеневих метастазів на тварину та середній об'єм метастатичного ураження легень на тварину (Таблиця 1). 5 76922 6 Таблиця 1 Протипухлинний і антиметастатичний ефект цисплатину по відношенню до чутливої та резистентної карциноми 3LL Тип пухлини Група тварин Об'єм первинної пухлини (см3) Чутлива до циспла- контроль цистину 3LL платин Резистентна до ци- контроль циссплатину 3LL платин 1,4 0,4 1,4 1,3 0,03 0,03 0,05 0,06 Процент(%) Середня кіль- Процент(%) зменшенгальмування кість метаста- ня кількості легеневих росту пухлини зів на тварину метастазів 20,6 1,6 46 58 8,6 0,9 29,8 1,6* 3 11 26,4 2,2 Знаком * позначені вірогідні відмінності (р< 0,05) у порівнянні з чутливою пухлиною. В Таблиці 2 представлені дані по дослідженню сумарної активності серинових протеїназ в плазмі крові мишей в динаміці росту карциноми 3LL , чутливою та резистентною до цисплатину. Як видно з представлених даних, при дослідженні ПРА у тварин з пухлиною, чутливою до цисплатину, на всіх стадіях росту пухлини, відмічається зниження ак тивності протеїназ плазми крові у порівнянні з плазмою інтактних тварин. У тварин з пухлиною, резистентною до цисплатину, навпаки, на всіх стадіях росту пухлини, відмічається суттєве підвищення активності протеїназ плазми крові у порівнянні з плазмою інтактних тварин. Таблиця 2 Сумарна активність серинових протеїназ (ПРА) в плазмі крові при розвитку карциноми 3LL з різною чутливістю до цисплатину Тип пухлини Показники ПРА, % Чутлива до цисплатину Об'єм первинної пухлини, мм3 3LL Середня кількість метастазів ПРА, % Резистентна до цисп- Об'єм первинної пухлини, мм латину 3LL Середня кількість метастазів Стадії росту пухлини стадія експоненційного росту термінальна стадія 67,8 5 53 5,7 0,33 0,06 1,52 0,15 7,0 0,9 20,6 1,6 221 25,2* 219 42,5* 0,34 0,07 1,5 0,17 9,9 0,8* 29,8 1,6* Знаком *позначені вірогідні відмінності (р