Спосіб оцінки функціонального стану слизової оболонки порожнини рота

Спосіб оцінки функціонального стану слизової оболонки порожнини рота, що включає відбір матеріалу, його обробку та оцінку, який відрізняється тим, що відбір матеріалу проводять із захопленням слизової оболонки разом із власною пластинкою, із матеріалу виготовляють зрізи, які обробляють антитілами до маркерів імунокомпетентних клітин, а оцінка проводиться шляхом реєстрації їх КІЛЬКОСТІ та взаєморозташування слизової оболонки порожнини рота [Данилевський М Ф , Несин О Ф , Рахній Ж І Захворювання слизової оболонки порожнин рота -Київ "Здоровгя" 1998-406 с ] Для його здійснення матеріал дістається методом зскрібка, мазку, відбитка або перевідбитка (коли елемент враження слизової оболонки знаходяться в місцях, недоступних для одержання прямого відбитка), якщо і ці засоби неможливі, то препарат отримують із осаду ротової рідини За допомогою шпателя чи тампона, переносять матеріал на предметне скло, фіксують та забарвлюють одним із прийнятих поліхромних (по Папаніколау, Романовському-Гімзе та ін) або спеціальних методів При вивчені препаратів виявляють такі КЛІТИННІ елементи клітини гематогенного походженнянейтрофільні гранулоцити, еозинофіли, лімфоцити та ш , клітини гістогенного походження фібробласти, пстюцити, плазмоцити тощо, клітини епітелію - зроговілі, схильні до зроговіння, атипові, акантолітичні (клітини Тцанка), специфічні клітини - типу Лангтанса, епітелюїдні, "монструозні", клітини герпесу Крім того визначають мікроорганізми коки, веретеноподібні бактерії, спірохети, гриби Визначають якісне й кількісне співвідношення нейтрофільних гранулоцитів, активність фагоцитозу Індекс кератинізацм виявляє ступінь кератинізацм Для одержання індексу кератинізацм обчислюють загальну КІЛЬКІСТЬ епітеліальних клітин у полі зору мікроскопа, потім КІЛЬКІСТЬ виявлених ю 00 48519 зроговілих клітин множать на сто і ділять на їх загальне число Зниження індексу кератинізацм при динамічному обстеженні свідчить про спад захисної функції слизової оболонки ВІДПОВІДНО ДО ЦИТОЛОГІЧНОЇ класифікації в епі телії порожнини рота вилучають базальні, парабазальні, проміжні та поверхневі клітини, а в ділянках, які піддаються зроговіванню, - також і рогові лусочки Суттєвими недоліками цього методу є низька інформативність та низька достовірність, що обумовлені наступними обставинами 1 Матеріал, що забирається для дослідження, знаходиться на поверхні епітелію і не може відображати функціональний стан глибше розташованих шарів 2 Клітини, ЩО МОЖЛИВО піддати дослідженню даним методом, знаходяться на останніх етапах ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ Тому не можуть у повній мірі характеризувати живу тканину 3 Внаслідок росту КІЛЬКОСТІ алергічних захворювань слизової оболонки порожнини рота постає необхідність глибокого вивчення імунокомпетентних клітин, що неможливо досягти даним методом 4 Даний метод взагалі не дозволяє виявити функціонально активні імунокомпетентні клітини, диференціювати їх та спостерігати взаємовідносини між ними В основу винаходу поставлено завдання підвищення інформативності та достовірності цитологічного методу Поставлене завдання вирішується шляхом дослідження імунофенотипу активно функціонуючих клітин бюптатів слизової оболонки разом з власною пластинкою, що відбираються з визначених ділянок слизової оболонки порожнини рота Визначення антигену на тканинних зрізах імуНОПСТОХІМІЧНИМ (стрептавідш-пероксидазним) ме тодом здійснюється наступним шляхом Для дослідження поверхневих антигенів використовували зрізи товщиною 5 - 7мкм, що їх отримували на кріостаті і потім фіксували в охолодженому до 20°С ацетоні Метод, що пропонується, включає три реакції і полягає у взаємодії антигена з антитілом Спочатку тканинний антиген взаємодіє з первинними антитілами (мишачими), які є специфічними маркерами Друга реакція відбувається між анти-мишачими та первинними антитілами, при цьому останні мічені біотином Третя реакція проходить внаслідок взаємодії біотину зі стрептавідшпероксидазою Виявлення активності пероксидази проводилось з використанням діамінобензидина солянокислого Кінцевим продуктом ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції є нерозчинний пігмент коричневого кольору, що випадає в МІСТІ знаходження антигену (зовнішня мембрана або цитоплазма клітини) Для оцінки експерименту проводять негативний контроль із нормальною мишачою сироваткою замість первинних антитіл Негативний контроль не забарвлюється Оцінку результатів проводили порівнюючи інтенсивність забарвлення досліджуванихпрепаратів із негативним контролем Інтенсивність забарвлення препаратів, по відношенню до контролю ендогенної пероксидази, була різною, що залежить від її рівня в тканинах Підрахунок імунних клітин, що проявили себе позитивною реакцією, проводився на 100 епітеліальних клітин по всій товщі пласта епітелію У рахунок не брали забарвлені позитивно фрагменти клітин, які не мали ядерних структур Нами було досліджено слизову оболонку мілкого присінку порожнини рота у дітей із зубощелепними аномаліями віком 8-10 років на 26 інтраопераційних бюптатах, взятих під час вестибулопластики Із них 12 бюптатів було взято у дітей, яким застосовували передопераційну підготовку електрофорезом екстракту алое (із метою покращення загоєння післяопераційної рани) та 14 - без застосування даного препарату Первинні моноклональні антитіла, використані у дослідженні наведені у табл 1 Таблиця 1 Первинні антитіла CD3 CD4 CD8 CD14 CD16 CD20 HLA-DR Експресія Т-лімфоцити Т-хелпери/ індуктори Т-кілери/ супресори моноцити NK-клітини В-лімфоцити Моноциті, В-КЛІТИНИ, Розведення 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 1 5 КІЛЬКІСТЬ 5-Юмкл 5-Юмкл 5-Юмкл 5-Юмкл 5-Юмкл 5-Юмкл 5-Юмкл Виробник "Сорбент" Москва "Сорбент" Москва "Сорбент" Москва Sigma, США "Сорбент" Москва "Сорбент" Москва "Сорбент" Москва Активовані -клітини, дендритні АПК Отримані дані дозволили встановити локалізацію і КІЛЬКІСТЬ імунокомпетентних клітин в слизовій оболонці мілкого ППР Нами виявлено поодинокі CD3+- клітини, які локалізувались біля дистрофічно змінених епітеЛІОЦИТІВ КІЛЬКІСТЬ СО4+-Т-лімфоцитів в слизовій оболонці мілкого ППР складала 1 - 2 на 100 епітеліальних клітин, характерним було їх розташування в місцях близько до базальної мембрани СВ8+-клітини в епітелії були малочислен!, і локалізовані здебільшого в базальному (9 на 100 епітелюцитів) та шипуватому (6 клітин на 100 епітелюцитів) шарах Переважно ці клітини, розташовані на вершинах сосочків, утворених власною пластинкою епітеліальної оболонки У слизовій оболонці аномально прикріплених тканин ППР зустрічалося 4 - 5 CD14+- клітин на 100 епітелюцитів Вони розміщувалися по базальній мембрані CD16+ - клітини у слизовій оболонці мілкого ППР майже не зустрічались 48519 Нами було виявлено поодинокі СВ20 -клітини в товщі епітелію, локалізовані, в більшості випадків, під та над базальною мембраною, що пояснюється відсутністю гострих запальних процесів в досліджуваній ДІЛЯНЦІ слизової оболонки порожнини рота В наших дослідженнях чіткою імунопстохімічною реакцією проявили себе HLA-DR+ дендритні клітини, ідентифіковані за характерними відростками КІЛЬКІСТЬ дендрітних клітин в епітелії слизової оболонки мілкого присінку порожнини рота складала 9-10 на 100 епітелюцитів Характерною була локалізація дендрітних клітин в базальному, шипуватому та підслизовому шарах В даному випадку отримані дані свідчать про підвищення активності локального імунітету після підготовчої терапії екстрактом алое, що має важ ливе значення в процесі загоєння післяопераційної рани Після проведення електрофорезу в слизовій оболонці мілкого ППР з'являлися поодинокі CD16 + клітини, що розташовувались в шипуватому шарі (5 - 8 на 100 епітелюцитів) 4 + КІЛЬКІСТЬ І локалізація CD3 , CD4 та + СО8 після проведення терапії екстрактом алое, не змінювалась Однак спостерігалося незначне + + збільшення CD14 та CD20 клітин, їх розміщення залишалось тим же Проведене нами дослідження слизової оболонки мілкого присінку порожнини рота запропонованим методом свідчить про зміни в імунологічному статусі слизової оболонки порожнини рота, які можливо фіксувати та піддавати моніторингу в процесі лікування ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71