Спосіб культивування аеробних бактерій та спосіб очистки води

1 Спосіб культивування аеробних бактерій в анаеробних умовах, який включає вирощування бактерій в живильному середовищі, який відрізняється тим, що анаеробні умови створюють нанесенням на живильне середовище шару рідких насичених вуглеводнів і культивування здійснюють в присутності ІОНІВ змінновалентних елементів 2 Спосіб за п 1, який відрізняється тим, що як іон змінновалентного елементу використовують шестивалентний хром або чотиривалентний марганець 3 Спосіб очищення води від важкоокислювальних органічних сполук, що включає обробку води аеробними бактеріями, який відрізняється тим, що як бактерії використовують бактерії, які культивують по п 1, і очищення здійснюють в анаеробних умовах в присутності ІОНІВ змінновалентних елементів Винахід відноситься до області обробки води, а саме, до біологічного очищення стічних вод і може бути використаний для культивування аеробних бактерій, що використовуються для очищення води Відомий спосіб культивування аеробних бактерій, здатних до анаеробного дихання, які використовують шестивалентний хром, редукуючи його до тривалентного (Гвоздяк Н И , Могилевич Н Ф , Рыльский А Ф , Грищенко Н И Восстановление шестивалентного хрома коллекционными штаммами бактерій // Микробиология - 1986 - Т 55, №6 -С 962-965) [1] Суть способу Штам аеробної бактерії (Е coh) культивують в анаеробних умовах в колбах Ерленмейера об'ємом 250мл з 50мл поживного середовища під гумовими пробками Середовище культивування містить 10 - 30мг/дм3 хрому (VI) та глюкозу як джерело живлення Для видалення кисню систему продувають аргоном Мікроорганізми вирощують в аеробних умовах в м'ясопептонному бульйоні Нарощену біомасу бактерій вносять в середовище культивування В процесі культивування бактерій відбувається повне видалення з води шестивалентного хрому Як правило, до складу хромовмісних стічних вод входять важкоокислювані органічні сполуки Як показали наші дослідження, Е coh не реалізує процес відновлення хрому і видалення з води важ коокислюваної органіки, наприклад, фенолу Крім того, спосіб досить складний в реалізації, потребує спеціального обладнання, а також при проведенні додаткових досліджень подачу аргону необхідно проводити безперервно протягом всього періоду культивування Найбільш близькими до винаходу за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб культивування аеробних бактерій в аеробноанаеробних умовах та спосіб очищення води (Chirwa EM, Wang Y-T Simultaneous chromium (VI) reduction and phenol degradation in a fixed-film coculture bioreactor Water Res - 2001 - 35, N 8 P 1921 -1932) [2] Спосіб реалізується таким чином Бінарну культуру, що складається з Е coh та Р putida, культивують у середовищі з фенолом у концентрації 300мг/дм31 хромом з концентрацією 30мг/дм3 На першому етапі проводять культивування в аеробних умовах Середовище культивування аерують повітрям для нарощування біомаси аеробного штаму Р putida, яка є деструктором фенолу, концентрацію якого в середовищі періодично контролюють Після ПОВНОГО видалення фенолу з води аерацію припиняють, за рахунок чого створюються анаеробні умови для культивування Е coh Анаеробно-дихаючий штам Е coh в анаеробних умовах використовує шестивалентний хром як термінальний акцептор електронів та відновлює його до 00 о ю 54028 трьохвалентного, який є нерозчинним і тим самим видаляється з води відстоюванням Повністю очистка від фенолу та хрому відбувається за 48год культивування Недоліком даного способу є довготривалість процесу культивування і очищення, та значні енергетичні витрати, що обумовлені аерацією середовища В основу винаходу поставлена задача розробити спосіб культивування аеробних бактерій в анаеробних умовах, в якому використання нового прийому запобігання дифузії кисню в культуральне (поживне) середовище та використання нової природи окисника, забезпечило б спрощення, скорочення та здешевлення даного процесу Задачею винаходу є також розробка способу очистки води від важкоокислюваних органічних сполук аеробними бактеріями в анаеробних умовах, що дозволить прискорити процес при зменшених енергетичних витратах Для вирішення поставленої задачі запропоновано спосіб культивування аеробних бактерій в анаеробних умовах, що включає вирощування бактерій в поживному середовищі, в якому, згідно з винаходом, анаеробні умови створюють нанесенням шару рідких насичених вуглеводнів з довжиною вуглецевого ланцюга С15-С20 на поверхню середовища культивування і культивування здійснюють в присутності ІОНІВ змінновалентних елементів, причому як іон змінновалентного елементу використовують шестивалентний хром або чотиривалентий марганець Поставлена задача також вирішується способом очистки води від важкоокислюваних органічних сполук, в якому, згідно з винаходом, використовують аеробні бактерії, що культивують запропонованим способом і очистку здійснюють в анаеробних умовах в присутності ІОНІВ змінновалентних елементів Нами встановлено здатність облігатно - аеробних бактерій використовувати змінновалентні елементи як термінальні акцептори електронів, тобто дихати анаеробно При цьому анаеробні умови створюються нанесенням шару насичених вуглеводнів з довжиною вуглецевого ланцюга C-isС20, які перешкоджають доступу кисню до бактеріальних клітин із зовнішнього середовища Це дає можливість спростити процес культивування аеробних бактерій і проводити його без примусової аерації, що призводить до зниження енерговитрат Цей результат є новим, неочікуваним, бо вважається, що облігатно-аеробні бактерії здатні використовувати тільки кисень (Bergey's manual of systematic bacteriology / Eds Kney N R , Holt Y G , London Williams and Wilkms -1984 -V 1 -1549p) [3] Запропонований спосіб культивування аеробних бактерій в анаеробних умовах дозволяє розширити число видів аеробних бактерій, здатних проводити метаболічні процеси в анаеробних умовах в присутності змінновалентних елементів Спосіб культивування бактерій реалізується таким чином В стерильне поживне середовище з глюкозою вводять змінновалентні елементи Cr(VI) або Mn(IV) Хром вводять у концентрації 5 30мг/дм3, а марганець у вигляді нерозчинного оксиду МпС-2 в КІЛЬКОСТІ 10 - ЮОмг Середовище вносять в стерильні колби об'ємом 100см Потім В культуральне середовище вносять біомасу штамів бактерій Pseudomonas putida, Azotobacter vmelandn, Bacillus megatenum або Microcossus luteus в КІЛЬКОСТІ 200 - 300мг/дм3 кожної На поверхню культуральної рідини наносять шар насичених вуглеводнів з довжиною вуглецевого ланцюга C-isС20 Як вуглеводні використовують індивідуальні органічні речовини, наприклад, гептадекан, нонадекан, ейкозан, або їх суміш, наприклад, вазелінове масло (Общая органическая химия / под ред Д Б Бартона, У Д Оллиса - М Химия, 1981 -Т 1 - 736с) [4] Культивування здійснюють в термостаті при температурі 27 - 32°С В процесі культивування в присутності розчинного Cr(VI) утворюється нерозчинний гідроксид тривалентного хрому, який випадає в осад При наявності в розчині Mn(IV) у вигляді нерозчинного оксиду МпОг в процесі культивування утворюється розчинний Мп(ІІ) Процес культивування припиняють після повного відновлення змінновалентних елементів Початкову та поточну концентрацію Cr(VI) та Мп(ІІ) визначають колориметрично (фотоелектроколориметр КФК-2) Спосіб очистки води від важкоокислюваної органіки полягає в наступному В циліндричну ємність (бюреактор), об'ємом 1м3, в нижню и частину, за допомогою перистальтичного насосу із швидкістю розведення 0,028год 1 (тобто час перебування води в бюреакторі становить Збгод ) подають стічну воду Вода містить важкоокислювану органіку, наприклад фенол, та змінновалентні елементи (Cr(VI) або Mn(IV)) у масовому співвідношенні 3 1, ВІДПОВІДНО В бюреакторі розміщують волокнисту насадку з іммобілізованою біомасою культури Pseudomonas putida, або Azotobacter vmelandii, або Bacillus megatenum або Microcossus luteus [3], КІЛЬКІСТЬ біомаси становить 2г/дм3 (за сухою вагою) Анаеробні умови створюються поглинанням бактеріями розчиненого кисню із стічної води і забезпечуються герметичністю системи У витікаючій з верхньої частини бюреактора воді вимірюють концентрації важкоокислюваних органічних сполук та змінновалентних елементів Концентрацію фенолу у ВИХІДНІЙ та очищеній воді визначають спектрофотометричні (СФ-46) Приклади реалізації за винаходом Приклад 1 Культивування хромат-редукуючих аеробних бактерій Культивування проводять у середовищі, що містить глюкозу в концентрації 1г/дм3 як донор електронів та Cr(VI) в концентрації 30мг/дм3 як термінальний акцептор електронів ЮОмл середовища вносять в колби Ерленмейера об'ємом ЮОдм3 Колекційний штам бактерії Р putida вирощують на твердому середовищі МПА та вносять в середовище культивування в КІЛЬКОСТІ 200МГ/ДМ 3 Поверхню розчину заливають 2см шаром стерильного вазелінового масла (суміш насичених вуглеводнів з довжиною вуглецевого ланцюга С15-С20) для створення анаеробних умов Відбір проб для аналізу здійснюють стерильним шприцем Культивування проводять до повного видалення хроMy(VI) у вигляді осаду Сг(ОН)з Приклад 2 Очистка води від фенолу в присутності хрому (VI) 54028 СТІЧНІ ВОДИ, ЩО МІСТЯТЬ фенол, у концентрації 300мг/дм3 та хром у концентрації 100мг/дм3, тобто при масовому співвідношенні 3 1 ВІДПОВІДНО, подають в бюреактор об'ємом 1м3 Культура бактерій Р putida іммобілізована на волокнистій насадці в КІЛЬКОСТІ 2г/дм3 Воду подають в нижню частину бюреактора за допомогою перистальтичного насосу із швидкістю розведення 0,028год 1 Час перебування води в бюреакторі становить Збгод , що забезпечує повну очистку води фенолу при одночасній очистці від Cr(VI) Приклад 3 Культивування Мп(І\/)-редукуючих аеробних бактерій Підготовку культурального середовища проводять як у прикладі 1 Mn(IV) вносять у вигляді оксиду МпОг у КІЛЬКОСТІ ЮОМГ на 100см3 культурального розчину Колекційний штам бактерії A vmelandn вирощують на твердому середовищі МПАта вносять в середовище культивування в КІЛЬКОСТІ 200мг/дм3 Поверхню розчину заливають шаром стерильного ейкозану Процес культивування контролюють утворенням Мп(ІІ) в процесі редукції Mn(IV) аеробними бактеріями Про закінчення процесу свідчить незмінність концентрації Мп(ІІ) в розчині Приклад 4 Очистка води від фенолу в присутності марганцю (IV) В бюреактор об'ємом 1м3 подають СТІЧНІ ВОДИ, що містять фенол, у концентрації 300мг/дм3 та МпОг у КІЛЬКОСТІ 1г, тобто при масовому співвідношенні 3 1 , ВІДПОВІДНО Культура бактерій А vmelandn, іммобілізована на волокнистій насадці в КІЛЬКОСТІ 2г/дм3 Воду подають в нижню частину бюреактора за допомогою перистальтичного насосу із швидкістю розведення 0,028год 1 Час перебування води в бюреакторі становить Збгод , що забезпечує повне окислення фенолу в СТІЧНІЙ воді Ефективність очистки від важкоокислюваних органічних сполук в присутності змінновалентних елементів досягається такими аеробними бактеріями як Pseudomonas putida, Azotobacter vmelandii, Bacillus megatenum або Microcossus luteus, при використанні насичених вуглеводнів гептадекану, нонадекану, ейкозану, або їх суміші, наприклад, вазелінового масла Експериментально встановлено, що оптимальним діапазоном концентрацій шестивалентного хрому для культивування бактерій є 5 -ь 30мг/дм3, що забезпечує ефективний процес анаеробного дихання Концентрація Cr(VI) менше 5мг/дм3 недо статня для бактеріального переходу з аеробного на анаеробне дихання, тому и використання не доцільне Концентрації Cr(VI) вищі 30мг/дм3, ВІДПОВІДНО, ТОКСИЧНІ для неадаптованих культур бак терій Введення Mn(IV) у вигляді нерозчинного оксиду МпОг у КІЛЬКОСТІ ЮМГ на 100см також забезпечує ефективний процес анаеробного дихання При КІЛЬКОСТІ МпОг менше Юмг на 100см приріст біомаси недостатній для культивування бактерій Використання МпСЬ в кількостях більше ЮОмг на 100см3 не раціонально Визначено, що для створення анаеробних умов оптимальним є використання насичених вуглеводнів з довжиною вуглецевого ланцюга С15-С20 Насичені вуглеводні з довжиною вуглецевого ланцюга менше ніж С-І5 леткі і тому не можуть бути використані Насичені вуглеводні з довжиною вуглецевого ланцюга більше ніж С20 схильні до затвердіння і можуть привести до розгерметизації системи культивування Переваги запропонованого способу культивування в порівнянні з відомим полягає в наступному Вперше запропоновано простий в реалізації спосіб культивування аеробних бактерій в анаеробних умовах в присутності змінновалентних елементів, що не потребує енергетичних витрат Запропонований спосіб дозволяє створювати необхідні анаеробні умови для культивування аеробних бактерій, вести безперервний контроль за процесом як аналітичними так і фізико-хімічними методами, так як шар насичених вуглеводнів забезпечує герметичність системі при втручанні ззовні, не потребує застосування складних технічних рішень для створення анаеробних умов Запропонований спосіб культивування дозволяє реалізувати ефективний спосіб очистки води від важкоокислюваних органічних сполук в присутності змінновалентних елементів Завдяки використанню анаеробнодихаючих бактерій очистка води не потребує енергетичних витрат для проведення примусової аерації для окислення органічних сполук та забезпечує скорочення часу на очистку в 1,5 рази Достоїнством запропонованого способу очистки є одночасність видалення крім важкоокислюваноі органіки токсичних змінновалентних елементів, наприклад, хрому (VI) ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)236-47-24