Спосіб контролю змін активності мікроорганізмів

Спосіб контролю змін активності мікроорганізмів, що включає вплив біологічних, Винахід відноситься до біотехнологм, а саме до методів контролю метаболічної активності мікроорганізмів, використовуваних у бютехнолопчних процесах, а також при тестуванні впливу різних факторів зовнішнього середовища ХІМІЧНИХ токсикантів, що містяться у водяному середовищі, фізичних, наприклад, електричного і магнітного полів, біологічно активних речовин ВІДОМІ способи контролю біологічної активності мікроорганізмів, засновані на визначенні фізюлого-бюхімічних показників швидкості росту біомаси, активності ферментів дихального ланцюга, інтенсивності фотосинтезу, швидкості виділення і КІЛЬКОСТІ продуктів мікробіологічного синтезу і т д Однак більшість з них не задовольняють всім основним вимогам, пропонованим до бютестів експресності (часто спостереження проводяться протягом декількох діб чи тижнів), приступності і простоти культивування тест-об'єктів і виконання бютесту, відтворюваності, вірогідності і чутливості Багато хто з контрольованих функцій не є інтегральними показниками метаболізму Відомий також метод контролю впливу фізичних, ХІМІЧНИХ і біологічних факторів на метаболізм морських бактерій, що світяться, по інтенсивності їх люмінісценцм (Кацев А М Аналіз біологічно активних речовин з використанням морських бактерій, які світяться /Матеріали Міжнародної науковопрактичної конференції «Нові технології одержання і застосування біологічно активних речовин» 20-25 травня, 2002, Алушта -с 112-113) Хоча інтенсивність люмінісценцм є інтегральним показником метаболізму, цей метод не може бути використаний на об'єктах, що не володіють люмінісцентною здатністю ХІМІЧНИХ та фізичних факторів на метаболічні процеси цих бюорганізмів, який відрізняється тим, що біомасу мікроорганізмів поміщають в дисперсійне середовище заданого складу електроліту, експонують протягом часу, необхідного для досягнення осмотичної рівноваги, після чого ще раз відокремлюють біомасу, вимірюють електропровідність дисперсійного середовища і по ВІДНОСНІЙ ЗМІНІ його електропровідності після ек спозиції біомаси визначають величину змін Найбільш близький до пропонованого електроальголопчний спосіб контролю забруднення природних вод, заснований на ЗМІНІ електричних параметрів клітинної мембрани (різниці електричних потенціалів і опору) у присутності в навколишнім середовищі токсичних речовин, обраний за прототип Однак цей спосіб досить складний і вимагає наявності спеціального устаткування для проведення електрофізіологічних вимірів, а також обмежений використанням як тест-об'єкт великих кліток харових водоростей Nitella flexihs (Юрин В М Електроальголопчний спосіб контролю забруднення природних вод /Методы биоиндикации и биотестирования природних вод Вып 1 -1987С 63-70) Задачею винаходу є створення кондуктометричного експрес-тесту метаболічної активності мікроорганізмів різних таксономічних груп, у тому числі, для бюмоніторингу навколишнього середовища, заснованого на визначенні відносної зміни електропровідності дисперсійного середовища після експозиції в ньому біомаси мікроорганізмів Матеріали і параметри операцій, що виконуються, дозволяють розширити як коло тест-об'єктів, так і області застосування пропонованого методу і при цьому прискорити і спростити процес Поставлена задача вирішується тим чином, що в способі контролю змін активності мікроорганізмів, який полягає в тім, що біомасу мікроорганізмів поміщають у дисперсійне середовище заданого складу електроліту та експонують протягом часу, необхідного для досягнення осмотичної рівноваги, з наступним відділенням біомаси і виміром електропровідності дисперсійного середовища, ВІДПОВІДНО до винаходу біомасу вносять у диспер 00 (О 1 ю 57468 контакту з біомасою хлореллы, вирощеної на сійне середовище відомої елеісгропровідності, стандартному живильному середовищі, приведені експонують протягом 20-30 хвилин, після чого біов табл 1 масу відокремлюють фільтруванням чи центрифуПриклад 5 Те ж, але біомасу вирощували на гуванням і вимірюють електропровідність дисперживильному середовищі Тамійя з додаванням сійного середовища Величину біологічно активної речовини індоліл-3-уксусноі кондуктометрического тесту визначають по 3 кислоти (ІУК) у концентрації 10мг/дм ВІДНОСНІЙ ЗМІНІ електропровідності середовища Приклад 6 Те ж, але біомасу вирощували на - = ДК/Кп и живильному середовищі Тамійя з додаванням після експозиції в ній біомаси , де біологічно активної речовини індоліл-3-уксусноі ДК = К 1 - К 0 3 кислоти (ІУК) у концентрації 30мг/дм Мікроорганізми протягом усього життя виділяПриклад 7 Бактерії Bacillus cereus вирощувають в навколишнє середовище продукти метаболіли на м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ) на мікрозму, більшість з яких є електроліти Зміна КІЛЬКІСНОбіологічній качалці при 25° С в плин 10 годин ГО І якісного складу позаклітинних метаболітів є Культуральну рідину фільтрували, біомасу експоінтегральним показником метаболізму клітки Крім нували в дистильованій воді протягом ЗО хвилин, того, під впливом несприятливих факторів зовнішпотім суспензію клітин центрифугували при 3000 нього середовища може змінюватися проникність об/хв і вимірювали електропровідність надосадоцитоплазматичної мембрани, що є первинною вої рідини за допомогою моста перемінного струму ланкою неспецифічної відповідної реакції організР-577 му на ЗОВНІШНІЙ вплив, що приводить до зміни концентраційних градієнтів і виходу електролітів із Дані відносної зміни електропровідності дисклітини (Иванов А Ю , Фомченков В М , Хасанова персійного середовища після контакту з біомасою Л А Токсическое действие гидроксилированных дріжджів від віку приведені в табл 1 ионов тяжелых металлов на цито плаз мати чес кую Приклад 8 Те ж, але біомасу експонували в мембрану бактериальних клеток //Микробиология розчині К 2 Сг 2 0 7 (0,05мгСг6+) 1997 - Т 66, №5 - С 89-91) Зміни мембранної проПриклад 9 Те ж, але біомасу експонували в никності, що спостерігаються, при несприятливих розчині К2СГ2О7 (0,5мгСг6+) впливах, передують появі видимих симптомів поПриклад 10 Мікроводорості Spirulma platensis разки клітин і можуть бути використані для ранньої вирощували на живильному а середовищі Зарродіагностики інтенсивності впливу, коли зміни в орука (Пиневич В Ви др Физиология растений ганізмі ще не носять необоротного характеру 1970 - Т 17, вип 5) протягом 10 діб при температурі 35° С, цілодобовому висвітленні і барботажі Приклад 1 Пекарські дріжджі Saccharomyces повітрям Культуральну рідину фільтрували, cereviseae вирощували на живильному середовибіомасу експонували протягом 40 хвилин у дисщі, що містить г/дм3 глюкоза - 30,0, пептон - 2,0, тильованій воді, потім суспензію клітин калій однозаміщений фосфорнокислий - 2,0, магфільтрували і вимірювали електропровідність наній сірчанокислий - 2,0, дріжджовий екстракт - 1,0, досадової рідини за допомогою моста перемінного на мікробіологічній качалці, при 28° С в плин 5 струму Р-577 годин Культуральну рідину центрифугували при Дані відносної зміни електропровідності дис3000об/хв протягом 10 хвилин, біомасу експонуваперсійного середовища після контакту з біомасою ли 20 хвилин у дистильованій воді, потім суспенспіруліни наведені у табл 1 зію кліток фільтрували через мікробіологічний фільтр і вимірювали електропровідність фільтрату Приклад 11 Те ж, але біомасу експонували в 2+ за допомогою моста перемінного струму Р-577 розчині CuSO4 5Н2О (0,05мг Си ) Приклад 12 Те ж, але біомасу експонували в Дані відносної зміни електропровідності дис2+ розчині CuSO4 5Н2О (0,4мг Си ) персійного середовища (дистильована вода) після Приклад 13 Те ж, але біомасу експонували в контакту з біомасою дріжджів від віку приведені в розчині CuSO4 5H2O (1,0мг Си2+) табл 1 Приклад 14 Мікроводорості Chlorella vnlgans Приклад 2 Те ж, але біомасу вирощували проЛАРГ-3 вирощували на живильному середовищі тягом 9 годин Тамійя (Владимирова М Г , Семененко В Е ИнтенПриклад 3 Те ж, але біомасу вирощували просивное культивирование одноклеточных водоростягом 13 годин лей - Изд-во АН СССР, М - 1962 - с 43) протягом Приклад 4 Мікроводорості Chlorella vnlgans 6 діб при температурі 30°, цілодобовому ЛАРГ-3 вирощували на живильному середовищі висвітленні і барботажі повітрям Культуральну Тамійя (Владимирова М Г, Семененко В Е Инрідину фільтрували, біомасу експонували протятенсивное культивирования одноклеточних водогом ЗО хвилин у дистильованій воді, після чого рослей - Изд-во АН СССР, М - 1962 - с 43) протясуспензію клітин фільтрували і вимірювали елекгом 6 діб при температурі 30° С, цілодобовому тропровідність фільтрату за допомогою моста певисвітленні і барботажі повітрям Культуральную ремінного струму Р-577 рідину центрифугували при 3000 об/хв протягом Дані відносної зміни електропровідності дис10 хвилин Біомасу експонували в дистильованюй персійного середовища (дистильована вода) після воді протягом ЗО хвилин, потім суспензію кліток контакту з біомасою хлорели наведені у табл 1 центрифугували і вимірювали електропровідність надосадової рідини за допомогою моста пеПриклад 15 Те ж, але Культуральну рідину ремінного струму Р-577 перед фільтруванням обробляли магнітним полем, створюваним електромагнітом ФМЛ-1, напруДані відносної зміни електропровідності дисженістю між полюсами 1 кЕ протягом ЗО хвилин персійного середовища (дистильована вода) після 57468 Приклад 16 Те ж, але Культуральну рідину перед фільтруванням обробляли магнітним полем, створюваним електромагнітом ФМЛ-1, напруженістю між полюсами ЗкЭ протягом ЗО хвилин Приклад 17 Бактерії Bacillus cerens вирощували на м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ) на мікробіологічній качалці при 25° С в плин 10 годин Культуральну рідину центрифугували при 3000 об /хв протягом 20 хвилин Біомасу експонували в дистильованій воді протягом ЗО хвилин, після чого суспензію кліток відокремлювали центрифугуванням і вимірювали електропровідність дисперсійного середовища за допомогою моста перемінного струму Р-577 Дані відносної зміни електропровідності дисперсійного середовища (дистильована вода) після контакту з біомасою Bacillus cereiis приведені в табл 1 Приклад 18 Те ж, але культуральну рідину перед центрифугуванням обробляли електричним полем напруженістю 5В/см (частота 50 Hz) у скляному осередку з графітовими електродами протягом ЗО хвилин Приклад 19 Те ж, але культуральну рідину перед центрифугуванням обробляли електричним полем напруженістю 10В/см (частота 50 Hz) у скляному осередку з графітовими електродами протягом ЗО хвилин Пропонований експрес-тест метаболічної активності мікроорганізмів може бути використаний для бютестування якості водяного середовища (природні і СТІЧНІ води), що містить токсичні речовини й у скринінгу біологічно активних речовин, а також для контролю стану мікроорганізмів у технологічних процесах, наприклад, у виробництві дріжджів, антибіотиків, ферментів і т д Таблиця 1 Спосіб контролю змінень активності мікроорганізмів Приклади Мікроорганізми 1 2 3 Дріжджі Saccharomyces cereviseae 4 5 6 Мікроводорості Chlorella vulgans ЛАРГ-3 7 8 9 Бактерії Bacillus cereus 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 Діючий фактор Відносна зміна електропровідності дисперсійного середовища, ДК/К0 Вік культури, годин 5 9 13 Бюлопчн активні речовини, 1УК мг/дм3 0 10 ЗО ТоксикантК2Сг2О?(мг Сго+/дм;>) 0 7,-8 9,1 8,3 8,5 10,2 11,0 9,1 97 0,5 Мікроводорості Spirulma platensis 0,05 10,9 То кс н кант CuSO4 5Н2О(мгСи^/дм;>) 0 0,05 0,4 1,0 Мікроводорості Chlorella vulgans ЛАРГ-3 Бактерії Bacillus cereus Комп'ютерна верстка М Мацело 8,0 8,5 9,2 98 Магнітне поле, напруженість кЕ 0 1 3 8,4 8,6 9,8 Електричне поле, напруженість В/см 0 5 10 Підписано до друку 05 07 2003 9,0 11 2 12,1 Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ТОВ "Міжнародний науковий комітет", вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна