Спосіб одержання біомаси мікроорганізмів

УКРАЇНА МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ (із) U A ОПИС іі»49484 (із, А (5i,6A23L1/30,A61K35/66 ( ДО ДЕКЛАРАЦІЙНОГО ПАТЕНТУ НА ВИНАХІД видається під відповідальність власника патенту (54, СПОСІБ ОДЕРЖАННЯ БІОМАСИ МІКРООРГАНІЗМІВ (21,2001128682 (22,17 12 2001 (24,16 09 2002 (46,16 09 2002, Бюл № 9, 2002 р (72, Юркова Ірина Миколаївна, Естрела-Льопіс Вікторю Рафаельович (73, ТАВРІЙСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ЇМ В І ВЕРНАДСЬКОГО (57, Спосіб одержання біомаси мікроорганізмів, що включає збагачення біомаси металами, який відрізняється тим, що попередньо одержують біологічно активні комплекси, що складаються з металів полісахаридів, вводять зазначені комплекси в се редовище, що містить суспензію кліток мікроорганізмів у воді, і відокремлюють збагачену металами біомасу, причому як полісахариди використовують, наприклад позаклітинні полісахариди спіруліни, дріжджів, хлорели, попередньо виділені з культурального середовища біомаси, яку збагачують, а як метали використовують метали-мікроелементи, наприклад срібло та золото, що змішують у співвідношенні полісахариди метал = 1 (1 - 5) і отримані комплекси вводять у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ від 0,005 до 0,5мг (по металу) на грам сухої речовини, після чого біомасу відокремлюють від культурального середовища Винахід відноситься до біотехнологм, а саме до способу збагачення біомаси мікроорганізмів біологічно активними комплексами позаклітинних полісахаридів (продуктів ЖИТТЄДІЯЛЬНОСТІ мікроорганізмів - мікроводоростей, дріжджів, бактерій) з металами і може бути використане для збагачення біологічно активних харчових добавок (таких, як спіруліна, дріжджі, бактерії й ш) металамимікроелементами У біотехнологм ВІДОМІ способи одержання біомаси спіруліни і пивних дріжджів, збагачених йодом, селеном, цинком, залізом, магнієм з метою одержання біологічно активних харчових добавок з більш високим змістом мікроелементів, необхідних для задоволення добової потреби людини Відомий спосіб збагачення біомаси спіруліни додатковими компонентами, наприклад, палуроновою кислотою шляхом механічного змішування біомаси сухої водорості з палуроновою кислотою (Патент Роси № 2137402, МКИ 6 А 23 L 1\30, БИ № 34, 1999 г) Даний спосіб має недолік, зв'язаний з тим, що додаткові компоненти можуть бути розподілені в кінцевому продукті нерівномірно, особливо при внесенні їх у мікрокількостях Відомий спосіб одержання біомаси, збагаченої цинком (Шахматова О А Дія цинку на активність антиоксидантных ферментів супероксидисмутази і каталази у спіруліні / Матеріали XI з'їзду Українського ботанічного товариства - Харків, 25 - 27 вересня - 2001 - с 430 - 431) Такий спосіб одер жання збагаченої біомаси передбачає внесення в живильне середовище підвищеної КІЛЬКОСТІ цинку з метою накопичування його в біомасі в процесі культивування Однак такий спосіб збагачення мікроелементами тривалий і погано контрольований, тому що залежить від будь-яких змін фізюлого-бюхімічних параметрів, що важко підтримувати при культивуванні у відкритих системах (наприклад, спіруліни і хлорели) Крім того, недоліком даного способу є обмеження по типу метал-мікроелемент, зв'язані з шпбірующою дією підвищених кількостей важких металів у живильному середовищі Особливо це відноситься до металів, що володіють олігодинамічною дією (біологічною дією дуже малих кількостей позитивних ІОНІВ на біологічні об'єкти), таким, як мідь, срібло, золото Задачею винаходу є створення способу збагачення біомаси, виробленої як харчова добавка, біологічно активними комплексами позаклітинних полісахаридів з металами-мікроелементами, у якому використовані матеріали і параметри вироблених операцій дозволяють розширити коло як металів, так і мікроорганізмів і при цьому прискорити і спростити процес збагачення біомаси Поставлена задача вирішується тим, що в пропонованому способі одержання біомаси мікроорганізмів, що включає збагачення біомаси металами, попередньо одержують комплекси металів з позаклітинними полісахаридами даної біомаси, а 00 49484 потім уводять зазначені комплекси в середовище, що містить суспензію біомаси мікроорганізмів у воді, з наступним відділенням збагаченої біомаси від культурального середовища ВІДПОВІДНО ДО винаходу попередньо виділені полісахариди змішують з металами (наприклад, золотом, сріблом) при співвідношенні полісахариди метал = 1 (1 - 5) з одержанням комплексів, що вводять у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ ВІД 0,005 до 0,5мг (по металу) на грам абсолютно сухої речовини (а с р ) після чого біомасу відокремлюють від культурального середовища Пропонований спосіб дозволяє збагачувати біомасу будь-яких видів мікроорганізмів (наприклад, мікроводоростей, дріжджів, бактерій) будьякими металами-мікроелементами (наприклад, міддю, цинком, кобальтом, залізом, марганцем), а також нетрадиційними біологічно активними металами - золотом і сріблом Хоча механізм біологічної дії золота і срібла недостатньо вивчений, безліч експериментальних наукових і КЛІНІЧНИХ даних указують на бюстимулюючий ефект малих доз цих металів на організм людини, що дозволяє вважати ці метали мікроелементами (Кульский Л А Срібна вода - К Наук думка, 1987, Войнар А И - Мікроелементи в живій природі - М Вища школа, 1962) При цьому комплекси, якими збагачується біомаса, сполучать біологічно активні властивості як позаклітинних полісахаридів, так і металівмікроелементів Введення в суспензію клітин мікроорганізмів комплексів металів з позаклітинними полісахаридами на відміну від вільних ІОНІВ металів дозволяє досить точно визначати умови обробки біомаси для кожного виду мікроорганізму та металу (вихідна концентрація комплексів, сорбційна ємність, час контакту), а застосування для збагачення біомаси вільних ІОНІВ металів робить цей процес погано контрольованим, тому що відбувається одночасно сорбція як вільних ІОНІВ металів, так і їхніх комплексів, сорбційна активність яких різна При цьому КІЛЬКІСТЬ комплексів позаклітинних полісахаридів з металами, що утворюються, залежить від КІЛЬКОСТІ полісахаридів, що виділяються, тобто від фізіологічної активності культури Комплекси металл-полісахарид не роблять впливу на фізюлого-бюхімічну активність клітини, що залежить від будь-яких змін умов культивування Ефективність збагачення біомаси мікроелементами (сорбція комплексів металл-полісахарид) визначалася на прикладі МІДІ, золота, срібла Як біомасу використовували промислові штами мікроорганізмів синезелені мікроводорості Spirulma platensis, зелені мікроводорості Chlorella vulgans ЛАРГ-3 і пивні дріжджі Saccharomyces cereviseae Приклади здійснювання винаходу Приклад 1 Мікроводорості Spirulma platensis вирощували на живильному середовищі Зарроука (Пиневич В В и др Изучение Spirulma platensis нового объекта для высокоинтенсивного культивирования / Физиология растений - 1970 - Т 17, вип 5, с 1037 - 1046) протягом 10 діб при температурі 35°С, цілодобовому висвітленні і барботажі повітрям Культуральну рідину фільтрували, біомасу промивали і ресуспендирували в дистильованій воді до концентрації 1г а с р / д м 3 Попередньо виділяли з культурального середовища й очищали позаклітинні полісахариди (Захарова И Я , Косенко Л В Методи вивчення мікробних полісахаридів - Київ Наук, думка, 1982 - 188 с), що змішували з розчином СиЭСч 5НгО у співвідношенні полісахариди (ПС) Си 2+ = 1 1 з метою одержання комплексів Си 2+ - ПС Отримані комплекси вводили у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ 0,5мг (по Си +) комплексів/дм3 (ЧИ 0,5МГ Си2+/г а с р) і витримували протягом 5 хвилин, після чого суспензію фільтрували Дані по сорбції комплексів Си 2+ - ПС на біомасі спіруліни приведені в табл 1 Приклад 2 Мікроводорості Chlorella vulgans ЛАРГ-3 вирощували на живильному середовищі Тамийя (Владимирова М Г і Семененко В Е Інтенсивне культивування одноклітинних водоростей Изд-во АН СРСР М , 1962 - 43 с ) протягом 5 діб при температурі 30°С, цілодобовому висвітленні і барботажі повітрям Культуральну рідину центрифугували при ЗОООоб /хв протягом 10 хвилин Біомасу промивали і ресуспендирували в дистильованій воді до концентрації 2г а с р / д м 3 Попередньо виділяли з культурального середовища хлорели й очищали позаклітинні полісахариди (аналогічно опису приклада 1), що змішували з розчином CUSO45H2O у співвідношенні ПС Си 2+ = 1 1,2 з метою одержання комплексів Си 2+ - ПС Отримані комплекси вводили у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ 2,4мг (по Си +) комплексів/дм3 (ЧИ 1,2мг Си2+/г а с р ), після чого суспензію центрифугували при ЗОООоб/хв протягом 10 хвилин Дані по сорбції комплексів Си 2+ - ПС на біомасі хлорели приведені в табл 1 Приклад 3 Пивні дріжджі Saccharomyces cereviseae вирощували на живильному середовищі, що утримує (г/дм3) глюкоза - 30,0, пептон - 2,0, калій однозаміщений фосфорнокислий - 2,0, магній сірчанокислий - 2,0, дріжджовий екстракт - 1,0, на мікробіологічній качалці, при 28°С протягом 10 годин Культуральну рідину центрифугували при ЗОООоб/хв протягом 10 хвилин Біомасу промивали і ресуспендирували в дистильованій воді до концентрації 5г а с р / д м Попередньо виділяли з культурального середовища дріжджів і очищали позаклітинні полісахариди (аналогічно опису приклада 1), що змішували з розчином CUSO45H2O у співвідношенні ПС Си 2+ = 1 1,5 з метою одержання комплексів Си 2+ - ПС Отримані комплекси вводили у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ 3,0мг (по Си +) комплексів/дм3 (ЧИ 0,6МГ (ПО Си2+)/м а с р ) і витримували протягом 15 хвилин Після ЦЬОГО суспензію центрифугували при ЗОООоб/хв протягом 10 хвилин Дані по сорбції комплексів Си 2+ - ПС на біомасі дріжджів приведені в табл 1 Приклад 4 Мікроводорості Spirulma platensis вирощували аналогічно опису приклада 1 Культуральну рідину фільтрували, біомасу промивали і ресуспендирували в дистильованій воді до конце 49484 нтрацм Зг а с р / д м Попередньо виділяли з культурального середовища спірулши й очищали позаклітинні полісахариди (аналогічно опису приклада 1), що змішували з розчином АдІЧОз у співвідношенні ПС Ад + = 1 1,3 з метою одержання комплексів Ад + - ПС Отримані комплекси вводили у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ 0,036мг (По Ад + ) комплекСІВ/ДМ 3 (чи 0,012мг (по Ад + )/г а с в ) і витримували протягом 10 хвилин, після чого суспензію фільтрували Дані по сорбції комплексів Ад + - ПС на біомасі спірулши приведені в табл 1 Приклад 5 Мікроводорості Chlorella vulgans ЛАРГ-3 вирощували аналогічно опису приклада 2 Культуральну рідину центрифугували при 3000об/хв протягом 10 хвилин Біомасу промивали і ресуспендирували в дистильованій воді до концентрації 7г а с р /дм Попередньо виділяли з культурального середовища хлорели й очищали позаклітинні полісахариди (аналогічно опису приклада 1), що змішували з розчином АдІЧОз у співвідношенні ПС Ад + = 1 1 , 5 з метою одержання комплексів Ад + - ПС Отримані комплекси вводили у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ 1,47мг (по Ад + ) комплекСІВ/ДМ 3 (чи 0,21мг (по Ад + )/г а с р ) і витримували протягом 20 хвилин Після цього суспензію центрифугували при ЗОООоб/хв протягом 10 хвилин Дані по сорбції комплексів Ад + - ПС на біомасі хлорели приведені в табл 1 Приклад 6 Пивні дріжджі Saccharomyces cereviseae вирощували аналогічно опису приклада З Культуральну рідину центрифугували при ЗОООоб/хв протягом 10 хвилин Біомасу промивали і ресуспендирували в дистильованій воді до концентрації Юг а с р /дм 3 Попередньо виділяли з культурального середовища хлорели й очищали позаклітинні полісахариди (аналогічно опису приклада 1), які змішували з розчином АдІЧОз у співвідношенні ПС Ад + = 1 1 , 7 з метою одержання комплексів Ад + - ПС Отримані комплекси вводили у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ 0,45мг (по Ад + ) комплекСІВ/ДМ 3 (чи 0,045мг (по Ад + )/г а с р ) і витримували протягом 25 хвилин Після цього суспензію центрифугували при ЗОООоб/хв протягом 10 хвилин Дані по сорбції комплексів Ад + - ПС на біомасі дріжджів приведені в табл 1 Приклад 7 Мікроводорості Spirulma platensis вирощували аналогічно опису прикладів 1 і 4 Культуральну рідину фільтрували, біомасу промивали і ресуспендирували в дистильованій воді до концентрації 2г а с р / д м 3 Попередньо виділяли з культурального середовища спірулши й очищали позаклітинні полісахариди (ВІДПОВІДНО ДО опису приклада 1), які змішували з розчином + у співвідношенні ПС А и 3 = 1 2,5 з метою одержання комплексів А и 3 + - ПС Отримані комплекси вводили у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ 0,028мг (по Аи + ) комплексів/дм 3 (ЧИ 0,01 4МГ (ПО Аи 3 + )/г а с р ) і витримували протягом 10 хвилин, після чого суспензію фільтрували Дані по сорбції комплексів Ад + - ПС на біомасі спірулши приведені в табл 1 Приклад 8 Мікроводорості Chlorella vulgans ЛАРГ-3 вирощували аналогічно опису прикладів 2 і 5 Культуральну рідину центрифугували при ЗОООоб/хв протягом 10 хвилин Біомасу промивали і ресуспендирували в дистильованій воді до концентрації 4г а с р / д м 3 Попередньо виділяли з культурального середовища хлорели й очищали позаклітинні полісахариди (аналогічно опису приклада 1), що змішували з розчином Н А и С М Н г О у співвідношенні ПС А и 3 + = 1 3,5 з метою одержання комплексів А и 3 + - ПС Отримані комплекси вводили у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ 0,52мг (по Аи + ) комплексів/дм 3 (ЧИ 0 , 1 3 М Г (ПО Аи 3 + )/г а с р ) і витримували протягом 20 хвилин Після цього суспензію центрифугували при ЗОООоб/хв протягом 10 хвилин Дані по сорбції комплексів А и 3 + - ПС на біомасі хлорели приведені в табл 1 Приклад 9 Пивні дріжджі Saccharomyces cereviseae вирощували аналогічно опису прикладів 3 і 6 Культуральну рідину цснтрифуїували при 3000 об/хв протягом 10 хвилин Біомасу промивали і ресуспендирували в дистильованій воді до концентрації 6г а с р / д м 3 Попередньо виділяли з культурального середовища дріжджів і очищали позаклітинні полісахариди (ВІДПОВІДНО ДО опису приклада 1), що змішували з розчином HAUCI44H2O у співвідношенні ПС А и 3 + =1 5 з метою одержання комплексів А и 3 + - ПС Отримані комплекси вводили у водяну суспензію біомаси в КІЛЬКОСТІ 0,12мг комплексів/дм 3 (чи 0,02мг (по Аи 3 + )/г а с р ) і витримували протягом 20 хвилин Після ЦЬОГО суспензію центрифугували при ЗОООоб /хв протягом 10 хвилин Дані по сорбції комплексів А и 3 + - ПС на біомасі дріжджів приведені в табл 1 Як видно з дані таблиці 1, пропонований спосіб дозволяє одержувати показники збагачення біомаси металами (бюсорбція металів), що залежать від поставленої мети - КІЛЬКОСТІ металу в біомасі, необхідного для підтримки оптимальної добової дози При цьому, биосорбция металів, що містяться в комплексі металл-полисахарид, може бути як мізерно малої (0,005 - 0,007мг Me на г а с р - приклади 4 і 7 ВІДПОВІДНО), так і більш високої - 0,2 - 0,5мг Ме/г а с р (приклади 1 - 3) 49484 Приклади 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Мікроорганізми Spirulma platensis Chlorella vulgans Saccharomyces cer Spirulma platensis Chlorella vulgans Saccharomyces cer Spirulma platensis Chlorella vulgans Saccharomyces cer Комплекси Me - ПС Cu' + - ПС Cu' + - ПС Cu' + - ПС Ag + - ПС Ag + - ПС Ag + - ПС Au' + - ПС Au' + - ПС Au' + - ПС Таблиця 1 Сорбційна ємність, мг/г а с р 0,2 0,5 0,3 0,005 0,1 0,02 0,007 0,06 0,01 ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71