Спосіб виявлення внутрішньоклітинного свинцю в органах експериментальних тварин

Спосіб виявлення внутрішньоклітинного свинцю в органах експериментальних тварин шляхом ультрапстохімічного дослідження тканин, який відрізняється тим, що попередньо протягом ЗО хвилин проводять перфузію органів теплим (+37°С) розчином фіксатора з кінцевим рН 7,2, приготованого ex tempore на основі 0,2 М кокаділатного буфера (рН 7,4-7,6) з вмістом по об'єму Винахід відноситься до медицини, а саме до мікроскопічної техніки (ультрапстохімії) і може бути використаний для морфо-функцюнального дослідження токсикокшетичних і токсикодинамічних процесів на клітинному і субклітинному рівнях, а також для морфологічної діагностики свинцевої інтоксикації в умовах експерименту Найближчим до запропонованого способу є ультрапстохімічний метод Тімма [Гайер Г Электронная гистохимия Пер с нем - М Мир, 1974 488 с ] Однак цей спосіб трудомісткий і не специфічний Низька його специфічність обумовлена тим, що за допомогою реакції сульфід-срібла в тканинах і клітинах внутрішніх органів може виявлятись ціла низка важких металів (свинець, платина, срібло, золото, кадмій, мідь, кобальт, нікель, цинк, олово, ртуть та ш ) у вигляді загальної групи В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб виявлення внутрішньоклітинного свинцю в органах експериментальних тварин шляхом ультрапстохімічного дослідження тканин, такими ХІМІЧНИМИ реагентами і в такій ПОСЛІДОВНОСТІ, ЯКІ 2,5 % глютарового альдегіду, 4 % параформу та З % біхромату калію, потім вирізають шматочки тканин розміром 1,0 х 1,0 х 1,0 мм, фіксують ДВІЧІ, по 12 годин, при температурі 4°С у свіжих порціях цього ж фіксатора, проводять цитохімічну реакцію, обробляючи шматочки тричі, по 12 годин, у 3 % розчині біхромату калію, приготованого на 0,2 М кокаділатному буфері (рН 7,2), після чого промивають тричі по ЗО хвилин у цьому ж буфері, фіксують 1 годину в 1 % розчині чотириокису осмію на 0,2 М кокаділатному буфері, зневоднюють у ацетонах, занурюють в епоксидну смолу, готують ультратонкі зрізи тканин та визначають наявність вмісту свинцю по утворенню в клітинах поліморфних, різного розміру електронно-щільних гранул і депозитів за допомогою трансмісійного електронного мікроскопа забезпечать високу специфічність способу, стабілізацію свинцю у внутрішньоклітинних структурах при ГІСТОХІМІЧНІЙ обробці зразків тканин, надійну і стабільну фіксацію клітинних ультраструктур для уникнення артефактів і зменшать трудомісткість способу Поставлена задача досягається тим, що органи тварин, які підлягають дослідженню, послідовно обробляють необхідний час із підтримкою температурного режиму і рН ХІМІЧНИМИ препаратами і розчинами, приготовленими на основі 0,2 М кокаділатного буферу (рН 7,4-7,6) для послідуючого проведення ГІСТОХІМІЧНОЇ реакції, виготовлення ультратонких зрізів і визначення в них під електронним мікроскопом наявності, або відсутності свинцю в тканинах ПІДДОСЛІДНИХ тварин Спосіб здійснюється таким чином ПІДДОСЛІДНИХ тварин, після введення їм в організм сполук свинцю різними способами наркотизують, роблять розтин черевної і/або грудної порожнини і через канюлю, яку накладають на черевний або грудний ВІДДІЛ аорти, або катетер, який вводять у лівий шлуночок серця здійснюють пер ю (О фузію органів на протязі ЗО хвилин теплим (+37°С) розчином фіксатору, який готують ex tempore на основі 0,2 М кокаділатного буферу з вмістом 2,5% по об'єму глютарового альдегіду, 4% параформу і 3% біхромату калію з кінцевим рН 7,2 Після цього вирізають із органів, які підлягають дослідженню (печінка, нирки, головний мозок, селезінка та ш) шматочки тканин розміром 1,0x1,0x1,0 мм, занурюють їх у свіжу порцію цього ж фіксатору Шматочки фіксують по 12 годин при температурі +4°С у двох свіжих порціях фіксатору, проводять цитохімічну реакцію, обробляючи шматочки тричі, по 12 годин у 3% розчині біхромату калію, який приготовлений на основі 0,2 М кокаділатного буферу з кінцевим рН 7,2 при температурі +4°С і промивають тричі, по ЗО хвилин у 0,1 М кокаділатному буфері Після ЦЬОГО шматочки фіксують 1 год в 1% розчині чотирьохокису осмію, зневожують у ацетонах, занурюють в епоксидну смолу для їх ущільнення Із залитих у смолу тканинних блоків за допомогою ультрамікротому типу LKB III готують ультратонкі зрізи, які досліджують за допомогою трансмісійного електронного мікроскопу типу ТЕМ 125К, або іншого аналогічного При спостереженні в електронному мікроскопі свинець виявляють у вигляді поліморфних електронно-щільних гранул, або аморфних електроннощільних депозитів які часто розташовуються у внутрішньоклітинних органах, або безпосередньо в цитоплазмі клітин, які мають не високу електронну ЩІЛЬНІСТЬ При наявності свинцю в клітинах, його відкладення спостерігаються на внутрішніх мембранах і в матріксі мітохондрій, у складі ЛІПІДНИХ гранул, у фаголізосомах, залишкових тільцях, та в гранулах ліпофусцину В окремих випадках (епітелій проксимальних ВІДДІЛКІВ нефрону нирок) свинець виявляється у вигляді аморфного або мілкогранулярного електронно-щільного матеріалу у складі білкових тілець Спосіб пояснюється таким прикладом Щуру вагою 200 г в черевну порожнину одноразово вводили 1,0 мл водного розчину ацетату свинцю в дозі 1/5 Dl_5o (5 мг/100 г маси) Через 72 години, під ефірним наркозом щуру робили розтин грудної порожнини і катетеризацію лівого шлуночку серця Через катетер під тиском 20 мм рт ст на протязі ЗО хвилин здійснювали перфузію внутрішніх органів щура теплим (+37°С) розчином фіксатору, який був приготовлений extempore на основі 0,2 М кокаділатного буферу з вмістом 2,5% по об'єму глютарового альдегіду, 4% параформу і 3% біхромату калію з кінцевим рН 7,2 Виток крові здійснювався через попередньо накладену канюлю на нижню полу вену Після цього виділяли печінку, з якої вирізали шматочки розміром 1,0 х 1,0 х 1,0 мм, занурювали їх у свіжу порцію фіксатору і витримували 12 годин, при температурі +4°С, після чого робили зміну фіксатору і продовжували фіксацію ще на протязі такого ж часу Після фіксації, шматочки обробляли тричі по 12 годин у 3% розчині біхромату калію, приготовленого на 0,2 М кокаділазному буфері з кінцевим рН 7,2 при тій же температурі Промивали тричі по ЗО хвилин 62175 у 0,1 М розчині буферу, фіксували їх у 1% розчині чотирьохокису осмію на протязі 1 год, зневожували у ацетонах, занурювали у суміш Епон-Аралдит і залишали на 48 годин для полімеризації 3 тканинних блоків за допомогою ультрамікротому LKB III готували ультратонкі зрізи, які досліджували у трансмісійному електронному мікроскопі ТЕМ 125К В гепатоцитах спостерігали накопичення свинцю в мітохондріях клітин у вигляді електронно-щільних, мілких гранул, розташованих на внутрішній поверхні внутрішніх мембран мітохондрій і їх внутрішньому матріксі, а також на ЗОВНІШНІЙ поверхні ЛІПІДНИХ внутрішньоклітинних крапель, у вигляді аморфного, електронно-щільного матеріалу та вторинних лізосомах, у складі гранул ліпофусцину Запропонований спосіб виявлення внутрішньоклітинного свинцю в органах експериментальних тварин дає можливість спостерігати різний характер накопичення свинцю у внутрішньоклітинних структурах Картина, що спостерігається в електронному мікроскопі пояснюється фотознімками (фіг 1, фіг 2, фіг 3, фіг 4) На фіг 1 представлено накопичення свинцю в мітохондрм гепатоциту у вигляді надто мілких електронно-щільних гранул, які розташовані практично на всій внутрішній поверхні и зовнішньої мембрани та у вигляді великих, округлої форми гранул, які розташовані на одному з полюсів внутрішнього матріксу мітохондрм (вказано стрілкою) На фіг 2 представлено накопичення свинцю в різних за характером пошкодженнях мітохондріях гепатоцитів Одна з мітохондрій, яка має надто просвітлений матрікс і порушені крісти, з окремими їх вакуолізованими фрагментами практично не містить свинцю Інша мітохондрія (вказано стрілкою) містить велику КІЛЬКІСТЬ свинцю, який розташовується у внутрішньому матріксі у вигляді мілкогранулярного та електронно-щільного аморфного матеріалу наряду з різнокаліберними, поліморфними електронно-щільними гранулами На фіг 3 представлено накопичення свинцю в жирових включеннях гепатоцитів, яке відбувається за рахунок взаємодії сполук свинцю з ліпідами Мілкогранулярний електронно-щільний матеріал в ЛІПІДНИХ краплях розташовується переважно по їх краю На фіг 4 представлено накопичення свинцю у складі осміфільних мембран мієліноподібних тілець, які розташовані в просвіті жовчних капілярів у вигляді мілких електронно-щільних гранул Спосіб дає можливість вивчати на клітинному і субклітинному рівнях організації живої системи токсикокшетичні характеристики і токсикодинаміку впливу свинцю і його сполук на живий організм при його екзогенному впливі в умовах токсикологічного експерименту, що вкрай необхідно для визначення механізмів біологічної дії свинцю на живий організм, розробки сучасних уявлень про морфогенез і патогенез свинцевих уражень, а також розробки способів діагностики, засобів та методів патогенетичної профілактики і лікування сатурнізму 62175 Комп'ютерна верстка Л Ціхановська Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119