Спосіб виявлення внутрішньоклітинного кальцію

Винахід відноситься до медицини, а саме до мікроскопічної техніки в цитохімії. Найближчим до запропонованого способу є флуоресцентний спосіб виявлення кальцію при допомозі моріна в гістологічних зрізах [Пирс Э. Гистохимия. - М„ 1962. - С. 872]. Однак внутрішньоклітинний катіонний кальцій цей спосіб не виявляє, оскільки розрахований на виявлення відкладень і агрегатів неорганічних сполук кальцію в тканинах. В основу винаходу поставлене завдання виявити вміст кальцію в клітинах шляхом відповідної обробки стандартних мазків клітинного матеріалу і подальшої люмінесцентної мікроскопії цих мазків, що забезпечить можливість діагностики "передхвороби", наслідків лікування хвороб та прогнозування їх розвитку. Суть винаходу полягає в тому, що сухі стандартні мазки клітинного матеріалу, що не контактували з водою, оброблені розчином 6-дезоксі-5-оксітетрацикліну гідрохлориду в безводнім метанолі при розведенні 1 : 10000 протягом 5 хвилин при кімнатній температурі і висушені на повітрі досліджують у люмінісцентнім мікроскопі. У випадку наявності яскравої золотисто-білої флуоресценції визначають присутність кальцію в клітині; яскравість люмінісценції тим більша, чим більша кількість кальцію накопичена в клітині. Різниця в інтенсивності люмінісценції клітин в залежності від їх фізіологічного (чи патологічного) стану настільки значна, що відпадає необхідність використання люмінісцентних фотометричних приставок, чи дуже дорогих мікроспектрофотометрів. Для практичних потреб цілком достатня напівкількісна оцінка рівня люмінісценції: "0" -люмінісценція на рівні фонової; "+" - яскравість клітин ледве перевершує фонову; "++" - клітини виявляються чітко завдяки помірній люмінісценції, яка, проте, значно перевершує фонову; "+++' - дуже яскраві клітини. Спосіб здійснюють таким шляхом. Сухі і тонкі мазки клітинного матеріалу, що не контактували з водою (кров, харкотиння, ексудати, трансудати, виділення Із ран та ін.), вертикально і косо ("лицем вниз") занурюють у попередньо профільтрований через паперовий фільтр розчин 6-дезоксі-5-оксітетрацикліну гідрохлориду в безводнім метанолі при розведенні 1 ; 10 000 на 5 хвилин при кімнатній температурі. Висушують на повітрі. На протязі всього дослідження не допускається контакт мазків з водою. Висушений мазок досліджують у люмінісцентнім мікроскопі при побільшенні Імерсійних об'єктивів 90х 10Ох, окулярів 7х - 10х, освітленні синьо-фіолетовими променями зі збуджуючим світлофільтром ФС-2. Використовують справу зі світлоподілюючою пластинкою "зелена" (параметри нм 360-44; нм 480-700). Запираючий світлофільтр ЖС-18 + ЖЗС 19, жовтий. Для зрізування інфрачервоної і червоної області спектру вкупі зі збуджуючим світлофільтром ставлять фільтр СЗС 24 (при використанні ртутної лампи ДРШ-250-3). Мікроскопи "Люмам И", або "Люмам Р". Як Імерсійні рідини використовують діметил- і діоктилфталати та спеціальні суміши, що затримують затихання Інтенсивності флуоресценції при тривалім опромінюванні мазків. В цитоплазмі клітин (лейкоцитів, лімфоцитів, моноцитів і Ін.), що містить накопичення катіонів кальцію, спостерігається яскрава золотисто-біла флуоресценція. Ядра клітин виглядають чорними фігурами характерної для кожної клітинної популяції форми. Еритроцити не флуоресціюють. Плазма, слиз, інші рідкі компоненти мазків, що висохли, виказують слабку зеленувато-сіру флуоресценцію. Контроль специфічності. Обробка контрольних мазків крові 1 % водним розчином соляної кислоти протягом 10 хвилин (Е. Пирс, 1962) приводить до повного зникнення флуоресценції в цитоплазмі клітин при подальшому пофарбуванні їх вищенаведеним способом. Клітини виявляються у вигляді блідих сірих "тіней", або зовсім не виявляються. Роль кальцію в життєдіяльності різних організмів при нормальних і патологічних фізіологічних процесах загальновідома. В нормі йонізований кальцій переміщується в клітини в дуже малій кількості (Д. Мецлер, 1980. Т. 3). Але для різних хвороб запального генезу характерним є накопичення значної кількості кальцію в цитоплазмі клітин, що . може бути використано для діагностики "передхвороби", прогнозування хвороби та ефективності її лікування.