Спосіб реєстрації генотипів кукурудзи

Спосіб реєстрації генотипів кукурудзи, що включає аналіз компонентів електрофоретичного спектра, який відрізняється тим, що здійснюють електрофоретичний розподіл у поліакриламідному гелі ампліфікованих фрагментів ДНК, отриманих за допомогою полімеразної ланцюгової реакції, і фіксують у вигляді формули алелі мікросателітних л о кусі в Винахід належить до біотехнологм і може (та використаний при ідентифікації і реєстрації інбредних ЛІНІЙ га гібридів кукурудзи Систематизація генетичних ресурсів рослин на основі ідентифікації генотипу та реєстрації сортів, біотинів, інбредних ЛІНІЙ, гібридів є однією з найбільш актуальних проблем прикладної генетики, селекції і насінництва Найбільш близьким до запропонованою технічного рішення є спосіб ідентифікації і реєстрації генотипів за електрофоретичними спектрами зеїну (Сидорова В В , Тимофеева Г И , Конарев В Г Идентификация и регистрация сортов, линий и гибридов кукурузы методами электрофореза зеина Сборник научных трудов по прикладной ботанике, генетике и селекции Т 154- Белковые маркеры в сортовой идентификации и регистрации генетических ресурсов культурных растений Ленинград 1987 С 61-76) Зеїн виділяють з окремих зернівок, проводять електрофорез в поліакріламідному гелі та аналізують компонентний склад зеїну При реєстрації генотипу отримані компоненти спектру зеїну записують у величинах відносної електрофоретичної мобільності ланцюгової реакції В основу винаходу поставлено задачу ідентифікації і реєстрації інбредних ЛІНІЙ І гібридів кукурудзи шляхом типування ДНК, що дозволить отримати унікальні ДНК-ові формули для кожного дослідженого генотипу і створити каталог інбредних ЛІНІЙ і гібридів кукурудзи за даними ДНК-типування Поставлена задача вирішується тим, що дослідження проводять методом ампліфікації ДНКтестуємих зразків за допомогою метода полімеразчної ланцюгової реакції (ПЛР), електрофорезу фрагментів ДНК в поліакриламідному гелі та запису спектра ДНК у вигляді формули, в якій відображено алельний склад досліджених локусів ВІДМІННИМИ ВІД прототипу ознаками у винаході, що заявляється, є спосіб підготовки зразка до аналізу, показник по якому ідентифікують генотипи Спосіб забезпечує високу точність та унікальність ідентифікації генотипів, не потребує наявності коштовного обладнання та реактивів Спосіб здійснюється таким чином 1 Виділення ДНК 1 см-сегмент паростка (чи будь-якого органу рослини - листя, коріння) чи зерно в 1,5мл-пробірці типу "епендорф" (далі епендорф) гомогенізувати скляним пестиком та залити лізуючим буфером (20,0mM Na3EDTA, 0,1 М ТрісНСІ рН 8 5 при 25°С, 1,4М NaCI, 2,0% СТАВ) до повної мацерації тканин Лізат шкубувати ЗОхв при 55°С Додати рівний об'єм (0,6мл) суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24 1 за об'ємом), перемішати до утворення білої емульсії Отриману суміш центрифугувати 5хв при 14000об/хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", водну фазу перенести в чистий епендорф До водної фази додати 0,5 обсягу (0,3мл) ізопропілового спирту, перемішати і осадити ДНК центрифугуванням при 14000об/хв протягом Даний спосіб вибрано як прототип До недоліків прототипу слід віднести низький рівень поліморфізму зеїну та наявність цих білків тільки в зерні Наявність невеликої КІЛЬКОСТІ компонентів електрофоретичного спектру зеїну (всього у ЛІНІЙ і гібридів кукурудзи зареєстровано 32 компоненти) не дозволяє отримати унікальні білкові формули для кожного генотипу З метою усунення вказаних недоліків пропонується спосіб реєстрації генотипів за даними електрофоретичних спектрів ДНК, отриманих в результаті ампліфікації локусів, що містять пперваріабельні мікросателітні ділянки, за допомогою полімеразної (О 62244 1хв на мікрофузі "Eppendorf 5415" Надосадну рідину злити, осад промити ДВІЧІ 0,5МЛ 70% етанолу центрифугувати при 14000об/хв протягом 1хв на мікрофузі "Eppendorf 5415", надосадну рідину злити Підсушити осад при кімнатній температурі 15-20хв і розчинити в 400мкл ТЕ-буферу (10,0тМ Тріс-НСІ, 1,0тМЕДТА) 2 Флюорометричне визначення концентрації ДНК Концентрацію виділеної ДНК визначити на флюорометрі "ТКО 100 Dedicated mini Fluorometer" ("Hoefer Scientific Instruments", США) у TNE-буфері (3M NaCI, 50mM Na2HPO4) у присутності флюоресцентного барвника Hoechst 33258 3 Проведення полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) ПЛР проводити у 0,5мкл-епендорфах з вико ристанням ампліфікатора "Терцик" СДНКтехнолопя", Росія) Реакційна суміш для проведення ПЛР об'ємом 20мкп містить 50,0mM KCI, 20,0тМ Тріс-НСІ рН 8,4 (25°С), 1,5mM MgCI2, 0,01% Твін-20, по 0,2тМ кожного dATP, dCTP, dTTP, dGTP, no 0,25mkM прямого і зворотного праймерів, 20нг ДНК і 1од ДНК-полімерази Taq Поверх реакційного розчину нашаровувати 50мкл мінеральної олії Температурний режим ампліфікації такий 94°С 1хв , 60°С 1хв , 72°С 2хв , початкова денатурація - 5хв , фінальна елонгація - Юхв КІЛЬКІСТЬ ЦИКЛІВ - 35 Аналізувати 20 мікросателітних локусів, розташованих на десятьох різних хромосомах В таблиці наведено номенклатуру SSR-локусів та ПОСЛІДОВНІСТЬ фланкуючих праймерів даних SSR-локусів Г ШЗЛИЇДЯ. деню характери от и і « W -ц -,j* j j * Ї 042 (1) iO4l О} phiO?!) (S) V ї ї П О tf*F&t РЧІЯ f J T t J * 1 j П j ATG TGG CCA ГСД TTC П TTO ОСТ t X C AQC GCC OCA %A И pW061 (P) ТЗ file* її" і С CO ДАТ T4JA A A1 AGC TGC П GACGTAA GAG A AC 62244 4 Електрофоретичний розподіл продуктів ампліфікації Продукти ПЛР-ампліфікацм (5мкл-аліквоту ПЛР-суміші) фракціонувати в 10% денатуруючому, (8М сечовина) поліакриламідному гелі в 1 х ТВЕбуфері ( 8 9 т М тріс, 8 9 т М борна кислота, 2 т М EDTA) при ПОСТІЙНІЙ напрузі 500В та температурі 60°С 1-2год залежно від довжини фрагментів ампліфікації Для приготування одного гелю розміром 16x18см товщиною 1мм необхідно змішати 12,5мл 8М сечовини, 12,5мл розчину 30% поліакриламіду з 8М сечовиною, 2,5мл 10 х ТВЕ-буферу, 25мкл ТМЕД, 50мкл 10% ПСА Гель залити у форми, як описано в керівництві користувача устаткування Перед нанесенням продуктів ампліфікації провести префорез на протязі ЗОхв при ПОСТІЙНІЙ напрузі 300В і температурі 60°С Для контролю за просуванням фрагментів ДНК в гелі зразок змішати з 1мкл денатуруючого буфера для нанесення (98% формамід, Ю т М ЕДТА рН8,0, 0,2% (w/v) бромфеноловий синій, 0,2% (w/v) ксиленціанол) та денатурувати протягом Зхв при 95°С, після чого швидко охолодити на льодяній бані та за допомогою гамильтонівського шприца нанести в лунку гелю Електрофорез припинити згідно з довжиною пробігу ксиленціанолу і ВІДПОВІДНО розміру фрагментів ампліфікації Дві крайні доріжки гелю повинні містити зразок ДНК з відомою молекулярною вагою Як стандарт молекулярної маси використовувати ДНК фага лямбда, рестриктовану EcoRI, ДНК pUC19, рестриктовану Mspl, чи ДНК pUC18, рестриктовану Taql 5 Візуалізація продуктів ампліфікації Поліакриламідний гель фарбувати ВІДПОВІДНО ДО методики гель покласти на 5хв у 10% етанол, перенести у Комп'ютерна верстка Т Чепелєва 1 % НІЧОз на Зхв Гель промити кілька разів дистильованою водою Витримати 20хв у 0.012М АдІЧОз у темряві, промити кілька разів дистильованою водою Інкубувати гель у відновлюючому розчині (0,28М Na 2 CO 3 (безводний), 0,019% формалін), змінюючи розчин у кожному разі його потемніння, до появи забарвлення фрагментів ампліфікації Промити кілька разів бід и етильованою водою, покласти в 10% оцтову кислоту на 2хв Промити 2хв бідистильованою водою Гелі зберігати між двома листами прозорої поліетиленової плівки Приклади конкретного використання запропонованого способу Приклад 1 Здійснювали ДНК-типування інбредної лінії F564c за даними електрофоретичного розподілу ампліфікованих алелів десятьох мікросателітних локусів Інбредна ЛІНІЯ F 5 6 4 C Є ГОМОЗИГОТ НОЮ за вісьма дослідженими локусами Записали ДНК-спектр у вигляді формули, в якій буква визначає код дослідженого локусу, нижній індекс - розмір отриманого алеля даного локусу (в п н ) (у випадку гомозиготного стану локусу вказували довжину одного алеля) A134B128C132D133E82F97G182H168I120J154 Приклад 2 Здійснювали ДНК-типування простого гібриду Роза за даними електрофоретичного розподілу ампліфікованих алелів десятьох мікросателітних локусів Записали ДНК-спектр у вигляді формули, в якій буква визначає код дослідженого локусу, нижній індекс - розмір отриманого алеля даного локусу (в п н) A134B128B144C128C132D125D133E94F89F97G177G182H161H168I 110I115J154J158 Формула гібрида підсумовує дані алельного розподілу ВІДПОВІДНИХ батьківських форм Підписне Тираж 39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119