Спосіб підвищення якості деконсервованих ембріонів, заморожених надшвидким методом

Спосіб підвищення якості деконсервованих ембріонів, заморожених над швидким методом, який включає розморожування ембріонів занурен ням пайєт у водяну баню при кімнатній температурі з наступними 5-хвилинними витримками в середовищах з 5% розчином гліцерину і 0,5М розчином сахарози та з 0.25М розчином сахарози й культивування у культуральному середовищі, який відрізняється тим, що розморожені ембріони вміщують у культуральне середовище, в яке додатково вводять біологічно активну речовину - препарат "Філомек" у концентрації 0,19-0,21%, а культивування ембріонів здійснюють в термостаті при температурі 37°С протягом 30-45 хвилин Винахід відноситься до галузі репродуктивної біотехнологм, зокрема, до способів покращення якості деконсервованих ембріонів великої рогатої худоби, а саме до способів розмороження ембріонів, заморожених над швидким методом Спосіб може бути використаний у бютехнолопчних центрах, племзаводах, племрепродукторах та господарствах і підприємствах, які здійснюють трансплантацію ембріонів для прискореного відтворення високопродуктивних тварин Відомий спосіб розморожування ембріонів (Кузнецов В Є , автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук "Цитогенетичні аспекти розвитку in vitro доімплантаційних зародків ссавців, отриманих бютехнолопчними методами", 1999р), який включає використання середовища, що містить 0,5М розчин сахарози, в якому розморожені ембріони витримують 5 хвилин із наступним перенесенням у розчин фосфатносольового буфера (PBS) із 20% фетальною сироваткою теляти, після чого розморожені ембріони, для культивування, вносять у культуральне середовище Спосіб забезпечує 65% виживання деконсервованих ембріонів, запліднених in vitro, та біля 45% їх приживлення Недоліком відомого способу є низька якість деконсервованих ембріонів Найбільш близьким по суті до способу, що заявляється, є спосіб підвищення якості ембріонів, описаний Шаловило С Г (автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня доктора сільськогосподарських наук "Розробка наукових і практичних методів підвищення ефективності трансплантації ембріонів у племінному скотарстві", 1996р) Спосіб базується на використанні, при розморожуванні ембріонів, середовища, що містить 5% розчин гліцерину і 0,5М сахарози Далі ембріони поміщають у середовище з 0.25М розчином сахарози, із наступним перенесенням їх у культуральне середовище та здійснюють трансплантацію деконсервованих ембріонів Спосіб забезпечує 40% приживлення розморожених ембріонів Недоліком відомого способу є незадовільний рівень приживлення ембріонів Заявлений нами спосіб усуває недоліки прототипу і забезпечує одержання морфологічно повноцінних розморожених ембріонів, приживлення яких у реципієнтів становить 50-65 ВІДСОТКІВ В основу винаходу поставлено завдання розробити ефективний, економічно вигідний, зручний у застосуванні спосіб підвищення якості деконсервованих ембріонів, заморожених надшвидким методом, який би забезпечував одержання морфологічно повноцінних ембріонів із високим відсотком приживлення при трансплантації Технічний результат досягають шляхом поміщення деконсервованих відомим способом ембріонів у культуральне середовище, що містить препарат "Філомек" у концентрації 0,19-0,21% та культивуванням їх у ньому протягом 30-45 хвилин (О со сч (О 62361 утермостаті при температурі 37°С приємствах, які здійснюють трансплантацію ембріонів, і тому відповідає критерію винаходу " Додавання до культурального середовища промислова придатність" 0,19-0,21% препарату "Філомек" забезпечує 90% життєздатності деконсервованих ембріонів та 50Таким чином, заявлене технічне рішення є но65% їх приживлення після трансплантації реципієвим, промисловим придатним, має винахідницький нтам рівень, тобто відповідає всім умовам патентоспроможності винаходу ВІДПОВІДНО до статті 7 розПрепарат "Філомек" являє собою природну ділу II Закону України "Про охорону прав на винасубстанцію із тканин морських організмів на основі ходи і корисні моделі" №1771 - III, 2000p фосфоліпідів - фосфатидилхоліна й фосфатидилетаноламша (70-80%), які у своїй структурі мають У господарстві, де здійснюють трансплантацію біологічно активні поліненасичені жирні кислоти ембріонів заморожених над швидким методом, За рахунок властивостей фосфоліпідів і Q-3 поембріони для трансплантації готують наступним ліненасичених жирних кислот препарат "Філомек" чином ембріони, заморожені надшвидким метомає широкий спектр біологічної дії, зокрема, мемдом, розморожують у водяній бані при кімнатній браностабілізуючу дію, яка дає можливість реконтемпературі Після ЦЬОГО ембріони переносять у струювати, пошкоджені при крюконсервацм, комсередовище з 5% розчином гліцерину та 0,5М розпоненти мембран клітин Введення препарату чином сахарози і витримують 5 хвилин Потім ем"Філомек" у культуральне середовище забезпечує бріони поміщають у середовище з 0.25М розчином відновлення морфологічних та фізіологічних влассахарози на 5 хвилин, із подальшим перенесенням тивостей деконсервованих ембріонів та сприяє ембріонів у культуральне середовище, до якого підвищенню їх приживлення після трансплантації додають препарат "Філомек" у концентрації 0,2% У цьому середовищі ембріони культивують у терПри проведенні патентно-інформаційного помостаті при температурі 37°С протягом 30-45 хвишуку авторами і заявником виявлено технічне рілин, після чого оцінюють їх за морфологічними шення (прототип), що містить найбільшу КІЛЬКІСТЬ ознаками і трансплантують реципієнтам суттєвих ознак, спільних із заявленим способом Ефективність заявленого способу, його пере(Шаловило С Г, автореферат дисертації на здоваги перед прототипом та визначення оптимальної буття вченого ступеня доктора сільськогосподардози біологічно активного препарату "Філомек", що ських наук "Розробка наукових і практичних метовноситься у культуральне середовище для розмодів підвищення ефективності трансплантації рожених ембріонів підтверджено прикладами конембріонів у племінному скотарстві", 1996р) розкретного виконання способу мороження ембріонів здійснюють зануренням пайєт з ембріонами у водяну баню при кімнатній В господарстві їм Шевченка Жовківського ратемпературі з наступним перенесенням ембріонів йону Львівської області проведено підготовку ембу середовище з 5% розчином гліцерину і 0,5М розріонів, заморожених надшвидким методом, до чином сахарози на 5 хвилин та подальшим перетрансплантації їх телицям-реципієнтам Для цього несенням їх у середовище з 0.25М розчином сахабуло відібрано 47 ембріонів, які були поділені на 4 рози на 5 хвилин та культивування їх у групи культуральному середовищі Однак, наявність Ембріони І групи розморожувались за відомим зазначених, спільних із прототипом, ознак недоспособом (прототипом) із використанням при розстатня для одержання технічного результату, який морожуванні ембріонів середовища, що містить забезпечує заявлений спосіб 5% розчин гліцерину і 0,5М сахарози з подальшим перенесенням у середовище з 0 25М сахарози та Технічних рішень, які за сукупністю ознак покультуральне середовище вністю співпадали б із заявленим - не виявлено Ембріони II, III, IV груп розморожували за ноЦе дозволяє зробити висновок про ВІДПОВІДНІСТЬ вим способом із використанням у культуральному заявленого технічного рішення критерію винаходу середовищі біологічно активного препарату "Філо"новизна" мек" для відновлення фізіологічних функцій ембріУ патентній і науково-технічній інформації не онів знайдено технічних рішень, в яких були б описані У середовище для культивування ембріонів ВІДОМОСТІ про ознаки, що відрізняють заявлений II групи було додано препарат у мінімальній спосіб від прототипу і забезпечують досягнення дозі -0,19% технічного результату ( у культуральне середовиIII групи - у середній дозі 0,2% ще для культивування розморожених ембріонів додають препарат "Філомек" у концентрації 0,19IV групи - у максимальній дозі 0,21% 0,21% і культивують ембріони у термостаті при Життєздатність деконсервованих ембріонів температурі 37°С протягом 30-45 хвилин) Отже, культивованих у середовищах із додаванням різзаявлене технічне рішення не випливає явним них концентрацій препарату "Філомек" визначали чином із рівня техніки, що дозволяє зробити виза відновленням бластопорожнини і поверненням сновок про ВІДПОВІДНІСТЬ його критерію винаходу об'ємів бластомерів у їх вихідний стан Усі морфо"винахідницький рівень" логічно ПОВНОЦІННІ ембріони були пересаджені реципієнтам Рівень приживлення ембріонів визнаЗаявлений спосіб відноситься до галузі репрочали ректальною діагностикою на 60-й день після дуктивної біотехнологм, зокрема, до способів потрансплантації кращення якості деконсервованих ембріонів, заРезультати досліджень наведені у таблиці морожених над швидким методом і може бути використаний у бютехнолопчних центрах, племзаводах, племрепродукторах та господарствах і під 5 62361 6 Таблиця Життєздатність та функціональність деконсервованих ембріонів культивованих у різних середовищах Групи Показники прототип І група Розморожено ембріонів, шт Нормально розвинених після культивування, шт Виживання ембріонів, % Пересаджено ембріонів, шт Тільних реципієнтів, гол Приживлення, % 11 III група (0,2% конц Філомеку) 12 IV група (0,21% конц Філомеку) 12 9 10 11 9 81,1 9 4 44,44 83,3 10 5 50,0 91,6 11 7 63,63 75 9 3 33,33 Культивування ембріонів у середовищі з препаратом "Філомек" значно покращило їх морфологічну характеристику, зокрема, спостерігалося плавне повернення об'ємів бластомерів у їх вихідний стан та реекспансія бластопорожнини у ранніх бластоцист При цьому не спостерігалося морфологічних порушень У ембріонів першої групи, які культивувались у середовищі без вищевказаного препарату, відмі Комп'ютерна верстка Т Чепелєва ДОСЛІДНІ II група (0,19% конц Філомеку) 12 чалося незначне збільшення об'ємів бластомерів і часткове руйнування клітинної мембрани Як видно з таблиці 1, найвищий відсоток виживання деконсервованих ембріонів та приживлення їх після трансплантації, був у III групи, де у культуральне середовище для культивування було додано 0,2% концентрацію препарату "Філомек" Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119