Спосіб визначення токсичної і мутагенної дії пестицидів на мікробні угруповання грунту

Спосіб визначення токсичної і мутагенної дії пестицидів на мікробні угруповання ґрунту, який відрізняється тим, що на природні асоціації мікроорганізмів, які є у водній суспензії ґрунту, діють розчинами пестицидів і визначають відсоток виживших мікроорганізмів, що характеризує токсичність пестицидів та частоту появи стрептоміциностійких мутантів, що характеризує мутагенну дію препаратів Винахід відноситься до експериментальної мікробіологи, а саме до способів визначення токсичної і мутагенної дії пестицидів на мікроорганізми Відомо використання культур ауксотрофних мікроорганізмів для визначення мутагенного впливу хімікатів [1, 2, 3] Аналогом є спосіб, в якому використані ауксотрофні штами мутантних мікроорганізмів Штам Eschenchia coll WP2 селекціонований ВІТКІН [4] і Бріджесом [5], його генотип несе точкову мутацію trp E65 (типу заміни пар азотистих основ), яка визначає ауксотрофи їсть клітин відносно триптофану На середовищі без триптофану будуть рости колони, які набули під дією мутагену здатності синтезувати його самостійно Відомий також спосіб визначення мутагенного впливу токсичних речовин з використанням тесткультур Salmonella thyphimunum TA100, Salmonella thyphimunum TA98 Штам S thyphimunum TA100 має мутацію типу заміни пар азотистих основ, а штам S thyphimunum TA98 - зсув рамки зчитування Штами селекціоновані в лабораторії Еймса [6] Обидві мутації визначають ауксотрофність по гістидину На середовищі без гістидину будуть рости тільки колонп-ревертанти, прототрофи відносно синтезу амінокислоти Недоліком зазначених вище способів є використання в якості моделі одного мікроорганізму, який до того ж не є представником ґрунтової мікробюти [7] Слід враховувати, що мікробний ценоз складається з багатьох видів мікроорганізмів, які мають різну реакцію на токсичну речовину Тому використання однієї культури є недостатнім Найбільш близьким за технічною суттю до винаходу, що заявляється, є спосіб визначення токсичності проб з використанням декількох мікроорганізмів [8] Спосіб передбачає використання мікроорганізмів (як мінімум двох штамів або двох видів клітин) З різною чутливістю до шкідливих речовин За різницею в чутливості визначають або розраховують графічно ті речовини, які мають більшу токсичну дію Недоліками прототипу являються 1 Обмежена КІЛЬКІСТЬ культур мікроорганізмів, які використовуються для тестування 2 Необхідність використання різних поживних середовищ для різних мікроорганізмів 3 Необхідність побудови графіків чутливості мікроорганізмів до різних токсичних речовин В основу винаходу поставлена задача розробки способу визначення токсичної і мутагенної дії пестицидів на мікробне угруповання ґрунту в цілому Задача вирішується наступним чином Фунгіцид, який вивчається, діє на все мікробне угруповання, яке міститься в суспензії ґрунту Відсоток виживання мікробного угруповання та частота появи мутантів за ознакою СТІЙКОСТІ ДО стрептоміцину, в залежності від індивідуальної чутливості кожного мікроорганізму до даної речовини, будуть змінюватися Для визначення токсичної і мутагенної дії фунгіциду на мікробне угруповання ґрунту проводять дослід за схемою (креслення фіг), що додається до опису заявки на винахід Приклад (О ю (О 62576 у всіх дозах викликають частоту мутацій у 1,5-3 рази вищу, порівняно із стандартним мутагеном Фундазол проявляв м'якшу дію порівняно з вітаваксом Треба звернути увагу на те, що підвищення виробничої дози для кожного з досліджуваних фунгіцидів в 10 разів, викликало збільшення частоти мутацій в 1,5-2 рази Отримані дані показали, що запропонований спосіб можна застосувати для первинної оцінки токсичної і мутагенної дії ХІМІЧНИХ препаратів на мікробні угруповання ґрунту, а також визначити оптимальні і безпечні за показниками токсичності і мутагенності дози їх використання Переваги запропонованого способу - можливість врахувати в одній схемі як токсичну так і мутагенну дію пестициду, - можливість оцінки реакції на токсичну речовину мікробного угруповання в цілому, - постановка досліду не потребує складного обладнання і дорогих поживних середовищ, - для обрахування результатів досліджень немає потреби в побудові додаткових графічних залежностей Література 1 Бариляк І Р , Дуган О М Еколого-генетичні дослідження в Україні // Цитология и генетика На середовищі із стрептоміцином враховували 2002 -№5 -сЗ-9 КІЛЬКІСТЬ стрептоміцинстійких колоній (Str+) Мутагенний ефект оцінювали по частоті мутацій, яку 2 Дуган А М , Журков В С , Абилев С К Кривизначали за відношенням КІЛЬКОСТІ КОЛОНІЙ натерии учета мутагенных эффектов в тесте Эймса чашках з стрептоміцином до КІЛЬКОСТІ КОЛОНІЙ на //Цитология и генетика -1990 -24, №6 -С 41-45 чашках без стрептоміцину При цьому, від значень, 3 Емнова Е Е , Меренюк Г В , Цуркан Л Г , одержаних у ДОСЛІДІ, віднімали значення, одержані Сланина В А Система оценки потенциальной геу контролі, оскільки показники одержані у контролі нетической опасности химических загрязнителей вказують на КІЛЬКІСТЬ мікроорганізмів, які володідля почвенных микроорганизмов / Методические ють природною СТІЙКІСТЮ до даного антибіотика рекомендации - Кишинев, 1991 -47с Дані, що характеризують токсичність препара4 Witkin Е М Ultraviolet-induced mutation and ту за показником відсотку виживання мікроорганіDNA repair // Annual Rev of Genetics 1 9 6 9 V 3 змів, наведені в таблиці 1 Всі досліджені фунгіциP 525-552 ди характеризувалися певним токсичним впливом 5 Bridges В A Simple bacterial systems for на мікробні угруповання Так, під дією фундазолу detecting mutagenic agents//Lab Pract 1972-V21, виживання зменшувалось до 35% Під дією вітава№6-P 413-416 ксу у виробничій дозі відсоток виживання був ще 6 Maron D , Ames В N Revised methods for the меншим 15,4%, а при збільшенні дози становив Salmonella mutagemcity test // Mut Res -1983 -V 113, 10,7% №3/4-P 173-215 Дані, що характеризують мутагенну дію пре7 Фонштейн Л М , Калинина Л М , Полухина паратів, наведені в табл 2 Дослідження частоти Г Н и др Тест-системы оценки мутагенной активмутацій у природних мікробних асоціаціях показаности загрязнителей среды на Salmonella (Метоли, що в ґрунті існують мікроорганізми, СТІЙКІ ДО дические указания) -М, 1977 -52с стрептоміцину (Str+) У варіантах без фунгіцидів, а 8 Пат 4317595 Германия, МКИ C12Q1/18 також при дії стандартного мутагену К2СГ2О7 приСпособ определения токсичности проб с применеродний рівень стрептоміцинстійких мікроорганізмів нием биотеста /Klam, Ursula (Германия) // Изобребув 5,7% Відсоток Str+ - колоній при обробці ґрунтения стран мира, -1996, №6, с 2, - вып 46 тової суспензії К2СГ2О7 зростав до 26% Якщо від9 Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволеняти відсоток мікроорганізмів, які володіють приних до використання в Україні Офіційне видання + родною СТІЙКІСТЮ, ТО КІЛЬКІСТЬ Str К Юнівест Маркетинг, 1999 -224с мікроорганізмів, які набули цієї здатності під дією 10 Emnova Е Рппсірміе de control microbiologic al solului / Informatie de smteza - Chismau, 2001 К2СГ2О7 буде 2 1 % Ці значення можна назвати 41 p частотою мутацій СТІЙКОСТІ ДО стрептоміцину Як показали результати досліджень, ХІМІЧНІ фунгіциди Для перевірки чутливості запропонованого способу було проведено визначення мутагенної дії на мікробний ценоз фунгіцидів, що використовуються у сільськогосподарському виробництві Досліджували грунт під озимою пшеницею, яка вирощувалась за традиційною агротехнолопєю Тип ґрунту - чорнозем звичайний, середньої потужності, малогумусний, важкосуглинковий на лесах Вивчали дію ХІМІЧНО синтезованих фунгіцидів фундазолу 50СП (беноміл 50%) і вітаваксу 200 ФФ (карбоксин 17%+тирам 17%) [9] Вивчення мутагенної дії фунгіцидів проводили у такий спосіб Імл 6 ґрунтової суспензії, розведеної до 10 засівали на рідке мінеральне середовище з дослідними фунгіцидами і шкубували 2 доби на качалках при температурі 28°С Контролями були варіант без фунгіцидів і варіант із стандартним мутагеном К2СГ2О7 в концентрації 200мкг/мл [10] Після інкубації суспензію висівали глибинно на два середовища на ґрунтовий агар і на агар із стрептоміцином (500мкг/л) Чашки Петрі шкубували 5 діб в термостаті при температурі 28°С На середовищі без стрептоміцину оцінювали токсичну дію фунгіцидів за різницею в чисельності колоній в ДОСЛІДІ І контролі без фунгіцидів 62576 Таблиця 1 Таблиця 2 Вплив мутагенів на виживання мікробного ценозу чорноземного ґрунту Вплив мутагенів на індукцію мутацій у мікробному ценозі чорноземного ґрунту Виживання, що вижили після % від контродії мутагену лю КІЛЬКІСТЬ КОЛОНІЙ, Мутагени Контроль без мутагенів К 2 Сг 2 0 7 Фундазол* Фундазол-ю** Віта вакс* Віта вакс ю** 2125 68 1048 744 327 227 + Мутагени Контроль без мутагенів К 2 Сг 2 0 7 Фундазол* Фундазолю** Віта вакс* Віта вакс-ю** 100 3,2 49,3 35,0 15,4 10,7 Примітка * - виробничі дози фунгіцидів ** - збільшені в 10 разів виробничі дози фунгіцидів Комп'ютерна верстка Н Лисенко Str -KonoHii, % ВІД ВИЖИВШИХ Частота мутацій, % 5,14 26,14 27,34 53,0 46,44 60,54 0 21,0 22,2 47,9 41,3 55,4 Примітка * - виробничі дози фунгіцидів ** - збільшені в 10 разів виробничі дози фунгіцидів Підписне Тираж39 прим Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, Львівська площа, 8, м Київ, МСП, 04655, Україна ДП "Український інститут промислової власності", вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119