Спосіб визначення сумарної мутагенної активності атмосферного повітря

Спосіб визначення сумарної мутагенної активності атмосферного повітря шляхом відбору проби її екстрагування який відрізняється тим що додатково вводять в пробірку з нативною 0 2% ДНК 1/10 досліджуваного розчину, до одержаної суміші додають 0,4 мп фізюлопчного розчину, пробу інкубують протягом 30 хвилин в темному МІСЦІ при кімнатній гем пературі після чого додають 2 0 мл 0 1 N НСІ і через 10 хвилин вимірюють екстинцію розчину, при н величині від 0.136 до 0 893 визначають сумарну мутаген ну активність атмосферною повітря Заявлений спосіб визначення сумарної мутагенної активності атмосферного повітря чараховують до галузі ГІГІЄНИ охорони навколишнього середовища для проведення моніторингу на наявність генотоксичних агентів в екологічних об'єктах і мікробіологічну технологію в санітарно-ппєнічних лабораторіях висока його трудомісткість і великі матеріальні затрати на його реалізацію Методичні рекомендації ВОЗ потребують певну кваліфікаційну підготовку персоналу лабораторій СЕС В районах розташування промислових підприємств проби повітря концентрують аспіраційним методом на фільтри (АФА ХА-20) в об'ємі 500 м 3 Фільтри послідовно екстрагують ефіром, етанолом та водою Органічний і водний екстракти висушують на роторному випарювачеві після чого ефірно-етанольну фракцію від кожної проби зливають з водою фракцією від тієї ж проби для наступного тестування Способом оцінки відносної небезпеки СМА об'єктів середовища може служити )х порівняння з "еталонним" об'єктом (наприклад, місто зі сприятливою екологічною ситуацією) Як відомо, тест Еймса грунтується на здатності декількох пстидінзалежних штамів Salmonella typhimunum (ТА 98 і ТА 100) мутувати в присутності мутагенних агентів Тому, коли в середовище з дефіцитом пстидіну додають канцероген (мутаген) зростання ревертантних колоній мікроорганізмів свідчить про прояв мутагенного ефекту Вивчаються і промутагени, я» завдяки монооксигеназам перетворюються в мутагени, що викликають появу ревертантних колоній мікроорганізмів До гомогенатів печінки додають водні розчини речовин, що вивчаються Проби •нкубують впродовж 1 години при 25°С Суміш охолоджують і екстрагують гексаном, щоб усунути ЛІПІДИ, а згодом - сірчаним ефіром В основу винаходу поставлена задача визначення сумарної мутагенної активності атмос (22)21 09 1999 (24) 15 03 2001 (46) 15 03 2001. Бюл № 2 2001 р (72) VMaHCbKHii Володимир Якович, Гринь Микола Васильович Сергеева Любов Анатоліївна. Бар'яхіар Марина Григорієвна (73) ДОНЕЦЬКИЙ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ЇМ МГОРЬКОГО може знайти застосування в ГІГІЄНІ праці, ГІГІЄНІ харчування, особистої ГІГІЄНИ щоб запобігти генетичні пошкодження у людини, що знаходиться в умовах мутагенного оточення Відомий спосіб визначення мутагенності зовнішнього середовища {1 Левина В В Малиновский О В Модификация радиационного повреждения хромосом в соматических клетках радиочувствительных мутантов дрозофилы Радиозащитное действие цистеамина // Радиобиология - 1993 - Т 33 - № 1 - С 154-159} шляхом проведення тестування на біологічних об'єктах проб з повітряного середовища Недолік відомого способу є тот факт що він не застосований в роботі санітарно-елідемюлопчноі служби, потребує певної научної кваліфікації лікувального персоналу Найбільш близьким по технічній суті пропонуємого способу є спосіб визначення мутагенних властивостей проб середовища на Salmonella typhimunum [2 Руководство по краткосрочным тестам для виявлення мутагенных и канцерогенных химических веществ - ВОЗ, Женева, 1989] шляхом відбору проби атмосферного повітря, її екстрагування і введення в культуру мікроорганізмів (пстидінчутливі штами) Недоліком відомого способу є ускладнення виконання кроків його діяння, що потребує 00 со ю со о» 35318 ферного повітря шляхом відбору проби, и екстрагування і проведення алкілування азотистих підвалин нативної дезоксирибонуклеїнової кислоти (ДНК) за допомогою мутагенів з проби повітря безпосередньо о пробірці а наступне визначення вільних підвалин, що утворюються проводять біохімічним методом Сутність способу складається в визначенні сумарної мутагенної активності атмосферно!о повітря шляхом відбору про^и повітря, їх екстрагуванням в КІЛЬКОСТІ 100 м і введенням 1/10 розчинного 1 10 диметилсульфоксидом (ДМСО) в пробу 0 2% ДНК додаванням до одоржаної суміші 0 4 мл фізіологічного розчину і інкубуванням протягом 30 хвилин в темному МІСЦІ при кімнатній температурі додаванням 2,0 мл 0,1 N НСІ і визначенням після 10 хвилин екстинци розчину на фотоелектроколориметрі, при н величині від 0,136 до 0,893 визначають сумарну мутагенну активність проб атмосферного повітря Новим з заявленому способі є введення 1/10 досліджуваного розчину в пробу з 0,2% ДНК додавання 0 4 мл фізіологічного розчину інкубації протягом 30 хвилин в темному МІСЦІ при кімнатній температурі наступного додавання 2,0 мл 0,1 N НС!, витримують 10 хвилин і вимірюють екстинцію розчину на ФЕК (довжина хвипі = 315 нм) при и величині від 0 136 до 0,893 визначають наявність сумарної мутагенної активності що дає можливість визначення в пробах повітря ксенобютиків з мутагенними властивостями Величезна КІЛЬКІСТЬ ХІМІЧНИХ речовин знаходиться в об'єктах оточуючих людину Навіть у питній вод» їх ідентифіковано сотні За існуючих темпів оцінки мутагенної небезпеки для їх вивчення потрібні десятки років Та оскільки їх КІЛЬКІСТЬ ПОСТІЙНО зростає очевидна потреба в нових швидких і простих методах дослідження Серед ХІМІЧНИХ сполук існують речовини, що володіють значною мутагенною активністю яка в сотні разів перевищує мутагенну активність короткохвильової радіації Такі речовини небезпечні у надзвичайно низьких концентраціях і не виявляються під час звичайного ХІМІЧНОГО аналізу В цьому випадку лише тест на мутагенність дозволяє визначити ступінь генетичної безпеки ЗОВНІШНЬОГО середовища Одним із ПІДХОДІВ служить метод оцінки навколишнього середовища при якому мі об'єкти безпосередньо випробовуються в біологічних тестсистемах з врахуванням усієї суми факторів, що в них містяться, зокрема мутагенних Цей ПІДХІД можна назвати оцінкою сумарної мутагенної активності (СМЛ) об'єктів навколишнього середовища, дозволяє, по-перше, оцінити реальну активність об'єкту середовища в цілому, а, по-друге, якщо ця активність виявляється високою, проводити хімічне фракціонування зразків цих об'єктів і виявляти окремі мутагенні фактори Методи приготування й аналізу проб для оцінки їх СМЛ концентрування води за допомогою випарювання в вакуумі та виморожування, екстракція за допомогою органічних розчинників (етанол, метанол, ацетон, гексан» диметилсульфоксид) для проб повітряних забруднень, а також методи холодної стерилізації проб за допомогою мембранних фільтрів (з діаметром пор 0,17-0,3 мкм) Мутагенез - це алкілування азотистих основ ДНК з активацією або без активації В живій КЛІТИНІ більшість реакцій пов'язаних з розривом зв'язків, призводять до утворення електрофільних та нуклеофшьних фрагментів молекул, співвідношення яких перебуває під гострим ензиматичним контролем Мутагени будучи сильними електрофільними реагентами, можуть без участі ферментів івязувати з нуклеофшьиими центрами тканинних компонентів порушуючи тим самим існуючу рівновагу Схематично розглянемо "долю" ХІМІЧНОГО мутагена під впливом на клітину in vitro На шляху мутагена в КЛІТИНІ першим бар'єром є клітинна мембрана, проникливість якої для різних речовин може значно варіювати Якщо цей бар'єр подолано сполука може бути зруйнованою метаболічними системами клітини (або навпаки, активованою) Перетворення речовин здійснюється завдяки комплексу ферментів, зосереджених в ендоплазматичному ретикулумі клітини, система яких позбавлена специфічності Відсутність характерних властивостей визначила розповсюджену назву ферментів - багатоцільові оксидази (БЦО) Відмічено диметилазну редуктазну і пдроксилазну (оксидазну) активність БЦО Для прояву ферментативної активності БЦО необхідний атмосферний кисень і НАДФ-Нг БЦО складається з декількох каталггичних компонентів - флавопротеїну. цигохрому Р-450 та ЛІПІДНОГО фактору Схема активації мутагенів для тесту СМА на STm Щоб приготувати гомогенат, щурів декапітували видаляли печінку здрібнювали їх в гомогенізаторі Поттера в охолодженому розчині КСІ (0,15 М) з розрахунку 1 г тканини на 3 мл розчину Одержану масу центрифугували при 9000д протягом 15 хв Супернатант використовували негайно в ДОСЛІДІ або зберігали в замороженому стані при -10°С і у разі необхідності розморожували при кімнатній температурі Щоб одержати 10 мл активуючої суміші до 5 мл гомогенату печінки додавали 34 мг НАДФ 15 мг глюкозо-6-фосфату 0.16 мл МдСІг (0,5 М) в 5 мл 0 2 М розчину фосфата натрію (рН 7,0-7,2 %) Та і продовження методики потребує чимало часу мікробіологічної технологи, затрат лабораторних тварин Дуже важкий і складний засіб у виконанні Для визначення СМА, виходять з ХІМІЧНОЇ характеристики молекули ДНК, підданої різному мутагенному впливові Коефіцієнт седиментації двониткової ДНК після подібної обробки різко спадає ДНК як носій генетичної інформації в силу своєї будови є цілком реактогенноздатною полімерною молекулою 3 точки зору особливостей взаємодії ХІМІЧНИХ мутагенів з ДНК виділяють три основні класи сполуки безпосередньо реагуючі з ДНК, сполуки, що включаються в клітинний метаболізм в результаті чого утворені продукти набувають здатності реагувати з ДНК, інтеркалюючі сполуки (дія останніх пов'язана з їх планарно ароматичною структурою, завдяки якій вони стерично вставляються між площинами основ ДНК, змінюючи структуру подвійної спіралі) Два з цих ми враховували Причому другий клас - в тесті на мишах. 35318 Реалізують спосіб наступним чином На дослідження беруть субстрат - високополімерну ДНК, одержану з тимуса телят (М маса 6200000 дальтон, вміст білка - 0 5 % РНК - сліди, фосфору - 7.8 %, азоту 13,2% співвідношення азот/фосфор дорівнює 1 7) Готували 0,2 % ДНК Відбирають 100 м 1 атмосферного повітря Також проби екстрагували і випарювали Після чого ефірно-етанольні фракції зливали з водною і цю пробу доводили до 10 мл ДМСО з розрахунку 1 м^/1 мл Від одержаної проби використали по 0 1 мп на дослідження (п=10) Паралельно ставили контроль на розчинник у такій же КІЛЬКОСТІ Нативну ДНК розчинювали у фізіологічному розчині до концентрації 0 2% На аналіз брали 0 5 мл розчину 0,2% ДНК + 0,1 мл досліджуваного розчину + 0 4 мл фізіологічного розчину Потім проби інкубували в темному МІСЦІ при кімнатній температурі впродовж ЗО хвилин Після інкубації додавали 2 0 мл 0 1 N НСІ і через 10 хв вимірювали екстинцію розчинів ДНК на ФЕК- і при довжині хвилі 315 нм (зелений світлофільтр) Якщо пригадати методики визначення ДНКаз на нативній ДНК то зміни екстинци розчину на 0 100 вважалися як 1 ОД ферментативної» активності В наших же дослідах зміни відбувалися порівняно з контрольною серією в межах від 0,136 (1,36 ОД) під впливом розчинника до 0 893 (8 93 ОД), під впливом ультрафіолетового опромінювання пробірок з нативною ДНК протягом ЗО хвилин довжинами хвиль в ДІЛЯНЦІ 219-253 нм що відрізняються мутагенним і канцерогенним ефектами При зміненнях екстинцн від 0 136 до 0 893 визначають наявність сумарно» мутагенно» активності Ми визначили що досліджувані концентрації атмосферного повітря мають мутагенну активність і в клітинах організму тварин Необхідність перенесення певної генотоксичності агентів у реальному оточенні людини з мікробіологічного об'єкту на оргамізм тварин підтверджується їх можливістю і нескладністю виконання в практичній охороні здоров'я Приклад 1. Перевірка методу в залежності від сили мутагенного впливу на нативну ДНК Приклад 2. Проби атмосферного повітря відбиралися в декількох самих небезпечних в плані розповсюдження атмосферних забруднень, точках району проживання Екстраговані фільтри проб атмосферного повітря об'єднувалися Звичайно, при збільшенні КІЛЬКОСТІ міст забору, якість і концентрація мутагенів у пробах повітря теж розширялася Хоча різниця у перевищенні ПДК ксенобіотиків у досліджуваних районах (Р і V) була відчутною, ступінь їх мутагенності міг дати і протилежну картину, ВІДПОВІДНО існуючій комбінації факторів (і не лише хімічної природи) а точці відбору За результатами екстинци розчинів ДНК, представлених в таблиці 1, можна зробити висновок, що перевищення вмісту в атмосферному повітрі послідовного району Р ксенобіотиків має відчутний зв'язок з їх мутагенністю Однак, ступінь кореляції між перевищенням ПДК і мутагенністю не вивчався, оскільки точки відбору в дослідженнях не співпадали з часом Приклад 3. Так само визначався і ступінь генотоксичності досліджуваних проб атмосферного повітря в організмі мишей Звичайно, чимало з передбачуваних мутаїенів активуються монооксигеназною системою печінки тому такі дослідження повинні проводитися паралельно В той же час, знову тяки не припускається наявність відчутного прямого кореляційного зв'язку між вказаними дослідженнями по районах з різним ступенем забруднення Імовірна така ситуація коли перевищення сумарної мутагенності у разі безпосереднього впмивзння нп нативну ДНК відбувається по одних речовинах а зростання мутагенності в організм» за /мови поєднання уже активованих печінкою метабопів >нших ксенобіотиків Але перше і друге визначення однаково важливі для формування висновків про генотоксичність агентів у досліджуваних об ектах які робляться з врахуванням антимутагенного захисного потенціалу всього організму Одержані розчинені в ДМСО екстракти проб повітря мишам уводили в концентрації 0,1 мл'100 г ваги тіла попередньо довівши до об'єму 0 1 мп фізіологічним розчином Через 24 години в короткостроковому тесті виділяли метафази» пластинки з кісткового мозку у забитих хлороформом тварин 3 таблиці випливає що ксенобютики активуючи МОС справді викликають підвищення рівня мутантних клітин в порівнянні з контрольною серією експериментальних тварин Однак достовірної різниці між ПІДДОСЛІДНИМИ районами не було Напевне, механізми активацій непрямих мута генів і противоборство антимутагенного захисного потенціалу організму в кожному конкретному випадку ХІМІЧНОГО впливання нівелює концен траційну різницю При цьому ступінь мутагенного впливу дешо видозмінюється Застосування запропонованого способу дає можливість підвищувати ефективність і результативність досліджень зробити «х підсильними в санітарно ГІГІЄНІЧНІЙ практиці впровадити швидше, на більш ранніх етапах засоби профілактики несприятливого впливу мутагенних факторів навколишнього середовища на організм людини Метод простий, час визначення 1 година (в порівнянні з 3-ма добами) Потребується менша КІЛЬКІСТЬ зконцентрованого атмосферного повітря для доказу наявності в пробах ксрнобютиків з мутагенними властивостями - 100 м 3 (в порівнянні з 500 м3) Це спрощує роботу СЄС і здійснює метод підсильним для санітарно-ппєнічної лабораторії робота яко» пов'язана ХІМІЧНИМИ токсикантами, тому що звичайно санітарно-ппєнімна лабораторія не може дозволити собі з'ясувати чи мають ХІМІЧНІ сполуки, знайдені в навколишньому середовищі, мутагенним ефектом з рахунком їх комплексного впливу на людину, і особливо в КІЛЬКОСТІ, ЩО не фіксуються звичайним ХІМІЧНИМ аналізом Вони не застосовують тест СМА на S Тгп Але, навіть, в порівнянні з тестом СМА на S Tm економиться час, реактиви, спрощуються етапи методики і не потрібні тривалі мікробіологічні пасажі для збереження штамів даних мікрооріанізмів Визначення займають загалом 1 годину і можуть впроваджуватися в практичну санітарно-епідемюлогечну службу При цьому буде нескладно проводити кореляційний аналіз, змінюючи концентрації тих чи інших генотоксичних агентів у конкретних точках вимірювання забруднення об'єктів середовища, оточуюючого людину. 35318 мина // Радиобиология - 1993. - Т 33 - № 1 - С. 154-159 2 Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ - ВОЗ, Женева, 1989 інформація 1 Левина В в Малиновский О В Модификация радиационного повреждения хромосом в соматических клетках радиочувствительных мутантоя дрозофилы Радиозащитное действие цистеа Розробка методу визначення сумарної мутагенної активності проб на нативній ДНК Таблиця 1 Середні значення екстинціі розчинів ДНК (п=10) % вмісту ДНК в пробі 1.7196 Назва проби 100 Контроль 1,0665* Уведення ДМСО 48 1,6594* УФЛ 62 0,8258" Спирт 96,5 Таблиця 2 Розробка методу визначення сумарної мутагенної активності проб атмосферного повітря на нативній ДНК Назва проби Середні значення екстинції розчинів ДНК (п=10) % вмісту ДНК в пробі Уведення ДМСО 1,6594* 96,5 Район Р, атм-не повітря. 5 точок відбору 1.5459** 89,9 Район Р, агм-не повітря, 10 точок відбору 1,4496** 84,3 Район Р. атм-не повітря, 20 точок відбору 1.3463** 78,2 Район V атм-не повітря 5 точок відбору 1,6520* 96,07 Район V, атм-не повітря. 10 точок відбору 1,5957* 92,8 Район V, атм-не повітря. 20 точок відбору 1,5221" 88,5 Примітка: * - вірогідність розбіжностей з контролем, при pU