Тест-система імуноферментна для напівкількісного аналізу та визначення авідності антитіл класу igg до вірусу простого герпесу 2 типу

Тест-система імуноферментна для напівкількісного аналізу та визначення авідності антитіл класу IgG до вірусу простого герпесу 2 типу, що включає імуносорбент, кон'югат моноклональних антитіл, набір реагентів для імуноферментного аналізу, яка відрізняється тим, що імуносорбент виготовлено на основі оригінального рекомбінантного білка gG2 HSV-2, пероксидазного кон'югата оригінальних моноклональних антитіл IgG людини та включає дисоціюючий розчин, який дозволяє відрізнити низькоавідні антитіла від високоавідних, що важливо при підтвердженні первинного захворювання. (19) (21) u201105124 (22) 22.04.2011 (24) 12.12.2011 (46) 12.12.2011, Бюл.№ 23, 2011 р. (72) ШЕВЧУК ВЕРОНІКА ОЛЕКСАНДРІВНА, СПІВАК МИКОЛА ЯКОВИЧ, КОВТОНЮК ГАЛИНА ВОЛОДИМИРІВНА, ГАНОВА ЛАРИСА ОЛЕКСАНДРІВНА, КОРШУН ЛЮДМИЛА МИКОЛАЇВНА, ГОРЛОВ ЮРІЙ ІВАНОВИЧ, ТЕРЕЩЕНКО МИХАЙЛО ІВАНОВИЧ, КИСЕЛЬОВА ОЛЕНА КОСТЯНТИНІВНА, ВУДМАСКА МАРІЯ ІВАНІВНА, МІХАЛАП СВІТЛАНА ВІТАЛІЇВНА, МОЙСА ЛАРИСА МИКОЛАЇВНА (73) ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д. К. ЗАБОЛОТНОГО НАН УКРАЇНИ 3 Не більш як через 5 хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра. Результат аналізу вважається позитивним, якщо ОГ досліджуваного зразка більше граничного значення. Значення ОГ зразка прямо пропорційне кількості специфічних антитіл. Для аналізу змін рівня антитіл в динаміці результат оцінюють в одиницях DIA Units (DU), які розраховують по формулі: (ОГ досліджуваного зразка : ГЗ) х 10. Результат більше 10 DU вважають позитивним, менше 9 DU - негативним. Визначення специфічних IgG проводять в парних сироватках крові, взятих від хворого з інтервалом 10-14 діб, в одній постановці ІФА. Досліджений матеріал від хворої було ідентифіковано як позитивний на наявність IgG до вірусу простого герпесу 2 типу. Приклад 2. Визначення авідності IgG антитіл до вірусу простого герпесу 2 типу в сироватці крові хворої А., 1985 року народження. Для цього у сусідні лунки імуносорбенту вносять по 100 мкл досліджуваного матеріалу від хворої та контрольні зразки (2 позитивних та 2 негативних), які попередньо розводять 1:51 розчином для розведення сироваток. Накривають планшет клейкою плівкою або кришкою та інкубують при температурі 37 °С протягом 60 хв. Потім імуносорбент відмивають двічі промивним розчином та рідину з лунок аспірують вошером. Лунки з досліджуваними зразками та позитивним контролем в непарних рядах заповнюють промивним розчином, а парних - дисоціюючим розчином. Об'єм буферів, які вносять складає -150 мкл/ в лунку. Планшет інкубують при 18-25 °С протягом 10 хв. Після відмивання планшета чотири рази в лунки додають кон'югат моноклональних антитіл проти IgG людини, що мічено пероксидазою, і інкубують при 37 °С протягом 30 хв. Далі імуносорбент відмивають шість разів та додають в лунки по 100 мкл розчину проявника (субстратний розчин з хромогеном) та інкубують при 18-22 °С у темряві 30 хв. 65454 4 Зупиняють кольорову реакцію, вносячи до всіх проб по 50 мкл стоп-реагенту. Не більш як через 5 хв. після зупинення кольорової реакції визначають оптичну густину (ОГ) в лунках у двохвильовому режимі за допомогою спектрофотометра. Індекс авідності специфічних антитіл розраховують за формулою: (ОГ зразка, обробленого дисоціюючим розчином / ОГ зразка, не обробленого дисоціюючим розчином) х 100 %. При індексі авідності специфічних антитіл менш 30 % сироватка містить низькоавідні антитіла, що підтверджує первинне захворювання. При індексі авідності специфічних антитіл більш 30 % сироватка містить високоавідні антитіла, що свідчить про перенесену раніше інфекцію. Приклад 3. Визначення чутливості та специфічності пропонованої тест-системи. Використовуючи пропоновану тест-систему і комерційний набір «ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ2-ОАвидность» (Нижній Новгород, Росія) [1], досліджували сироватки крові (по 50 достеменно позитивних сироваток, з яких 25 з низькоавідними специфічними антитілами та 25 - з високоавідними, і 100 достеменно негативних сироваток). Усі сироватки досліджували у двох повторах кожною тестсистемою за описаною методикою (табл.). Обидві тест-системи показали однакові результати: з 50 позитивних сироваток всі зразки виявлено як позитивні, що складає 100 % чутливості. З 100 негативних сироваток виявилися справді негативними 100 (специфічність - 100 %). Всі позитивні зразки з низькоавідними антитілами ідентифіковані в обох тест-системах позитивними, які містять низькоавідні специфічні антитіла. Всі позитивні зразки з високоавідними антитілами ідентифіковані в обох тест-системах позитивними, які містять високоавідні специфічні антитіла. Таким чином, пропонована тест-система забезпечує виявлення антитіл IgG до вірусу простого герпесу 2 типу з визначенням їх індексу авідності. Проста і надійна в роботі, проявляє високу чутливість та специфічність. Таблиця Результати порівняльного тестування позитивних та негативних сироваток в імуноферментних тест-системах різного виробництва Кількість досліджених сирова- Тест-система «ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ2-Gток Авидность», Росія, Нижній Новгород Позитивних, з яких: 50 низькоавідних 25 високоавідних 25 Негативних 100 Використана література 1. Інструкція по використанню імуноферментної тест-системи «ДС-ИФА-АНТИ-ВПГ2-GАвидность» виробництва Нижній Новгород, (Росія) 2010, 7 с. Тест-система «Dia-HSV-2-IgG-a», Україна, Київ 50 25 25 100 2. Співак М.Я., та ін. «Практичний посібник з Імуноферментного аналізу» м Київ, «Полімед» 2003 p., 48 с. 5 Комп’ютерна верстка Л. Купенко 65454 6 Підписне Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601